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研究背景2型糖尿病是一种遗传因素和环境因素共同作用而形成的多基因遗传性复杂疾病。近年来发病率逐年上升,严重危害了人类的身体健康并急剧加重了社会医疗成本。目前认为系统性(全身性)慢性炎症在2型糖尿病的发病机制中发挥着极其重要的作用。研究证实,肠道革兰氏阴性杆菌的细胞壁成分脂多糖(LPS)诱导的全身系统性炎症是2型糖尿病、肥胖等代谢性疾病发病机制中的重要因素。这种循环中的脂多糖水平较正常值高2-3倍的病理现象被定义为“代谢性内毒素血症”。内循环中增多的LPS不仅可以引起肝脏的炎症,促进肝脏纤维化,还可以导致肌肉、脂肪等组织的炎症,介导胰岛素抵抗的产生。在不良的生活方式如高脂饮食的影响下,脂质会在肠上皮间隙过度堆积,破坏肠道紧密连接结构,另外肠道微环境包括肠道菌群等的改变,还会触发肠道炎症,使得肠屏障功能受损,肠道通透性增加,从而导致LPS入血增多。提示肠黏膜屏障功能的损害是代谢性内毒素血症发生机制中极其重要的环节。在维持肠黏膜屏障正常功能的诸多因素中,紧密连接(TJ)的作用十分重要,其不仅是肠上皮机械屏障的最重要的结构基础,也是调节细胞旁物质转运的限速步骤。紧密连接(TJ)主要由跨膜蛋白claudin、occludin和膜周蛋白zonula occludens (ZO)等组成,主要功能是维持肠上皮细胞的极性和调节肠道屏障的通透性,减少肠道大分子和微生物通过肠壁进入机体内环境。益生元、益生菌等调节肠道菌群或改善肠道炎症的手段可以通过减轻2型糖尿病或肥胖大鼠的肠道紧密连接蛋白的损伤,减轻肠道炎症,减少肠道LPS进入机体内环境。改善肠黏膜屏障功能,降低肠道通透性,减少肠道细菌代谢产物如脂多糖进入血循环目前被认为是改善诸如肥胖、2型糖尿病等代谢性疾病的一种新的治疗策略。胰高血糖素样肽-2(glucagon-likepeptide-2,GLP-2)是肠道L细胞分泌的一种多肽类物质,也是肠上皮特异性生长因子,其促进肠黏膜生长的作用明显强于其他肠上皮生长因子,对损伤的肠道上皮拥有强大的修复功能,可以明显上调肠上皮紧密连接蛋白的表达,显著的改善肠黏膜屏障功能。同GLP-1类似,GLP-2也可以被DPP-4酶降解失活。另外有研究表明,在介导代谢性炎症及胰岛素抵抗中拥有极其重要功能的蛋白酶激活受体2(protease activated receptors 2,PAR2),在促进肠道炎症,诱导肠黏膜损伤方面也有着举足轻重的作用。肠道激活的PAR2不仅可以诱导肥大细胞脱颗粒和激活核转录因子NF-κB,促进炎性因子的释放和炎性细胞的迁移浸润,引起肠道黏膜的损伤,还可以通过激活胞浆中的ERKl/2,促使肠道紧密连接蛋白和其周围肌动蛋白的重新分布,增加肠道通透性。近期有研究发现,DPP-4酶可能作为PAR2的激动剂参与了PAR2的各项病理生理活动,推测抑制DPP-4酶的活性可能可以减少肠道PAR2的激活,减轻其介导的肠黏膜损伤作用。使用DPP-4酶抑制剂抑制肠道GLP-2的水解和PAR2的激活,可能会对2型糖尿病大鼠肠黏膜屏障功能起到保护作用,从而减少肠道LPS入血,减轻代谢性内毒素血症。本研究通过检测2型糖尿病大鼠近端结肠紧密连接蛋白ZO-1、occludin的表达及门静脉血浆LPS和相关炎症因子水平的变化,探讨DPP-4酶抑制剂利格列汀对肠黏膜屏障及代谢性内毒素血症的保护作用及其可能的机制,为挖掘DPP-4酶抑制剂降糖之外的作用、扩展DPP-4酶抑制剂在临床的应用范围以及治疗肥胖及胰岛素抵抗等相关疾病提供新的策略和依据。研究方法：30只SPF级雄性SD大鼠,体重在180-200g之间,使用随机数字表随机分为正常对照组(NC组,n=10)和糖尿病组(T2DM组,n=20),正常对照组予普通饲料喂养,糖尿病组予高脂饲料喂养,第8周末两组大鼠禁食12 h,糖尿病组大鼠腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ,35 mg/kg)2次(间隔7天)进行造模,普通饮食组同时腹腔注射等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。第9周末末次注射STZ 72 h后,门静脉取血测空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS),以胰岛素抵抗、空腹血糖≥111 mmol/L作为T2DM诊断的标准。将造模成功的大鼠按照随机数字表随机分为模型对照组和利格列汀干预组,利格列汀干预组予利格列汀3mg/kg/d连续灌胃4周,模型对照组和正常对照组均给予等体积生理盐水灌胃,继续饲养至13周末。观察各组大鼠食欲、毛发、大小便、行为及整体状态情况,根据大鼠体质量调整给药剂量。灌胃药液均每天配制。末次给药后,所有大鼠空腹过夜,称量体质量。以10%水合氯醛腹腔注射进行麻醉,经门静脉取血,离心取上清,-20℃保存,用于血清学指标的测定；截取近回盲部(<4cm)的近端结肠组织,于液氮中速冻,然后-80℃保存；全自动生化仪检测空腹血糖(Fasting Plasma Glucose,FPG)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、总胆固醇(Total Cholesterol,TC);酶联免疫吸附试验(Enzymes Linked Immunosorbent Assay,ELISA)法检测血浆胰岛素(Fasting plasma insulin,FIN),计算胰岛素敏感指数(Insulin Sensitivity Index,ISI)、胰岛素抵抗指数(Homeostasis model assessment-insulin resistance index,HOMA-IR)。ISI取自然对数纳入统计分析；利用鲎试剂采用终点显色法严格执行无热原操作检测血浆LPS含量；ELISA检测血浆肿瘤坏死因子-α、白介素-6以及二胺氧化酶的含量；免疫印迹法Western blot检测近端结肠组织中紧密连接蛋白ZO-1、occludin、胰高血糖素样肽-2及PAR2的含量。采用SPSS 19.0统计软件分析数据,GraphPad Prism6作图,数据以均数±标准差表示,进行正态性、方差齐性检验,若资料符合正态性、方差齐,多样本均数比较采用完全随机设计的方差分析,组间比较采用LSD检验；方差不齐时多样本均数比较采用近似F检验的Welch法；组间比较采用非参数检验的Tamhane’s T2法；以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果：1、高脂饮食9周联合2次链脲佐菌素腹腔注射(35mg/kg,间隔7天)成功制备2型糖尿病大鼠模型第9周末次注射STZ 72h后糖尿病组有4只大鼠死亡,剩余16只动物全部存活且空腹血糖均大于11.1 mmol/L,胰岛素敏感指数(ISI)明显降低,胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)明显增高,提示胰岛素抵抗明显,模型制备成功。造模及药物干预过程中,正常对照组大鼠活动正常,毛发整齐。模型对照组大鼠活动减少,精神萎靡,多尿且毛发暗淡凌乱。2、2型糖尿病大鼠肠道紧密连接蛋白表达下调,肠黏膜屏障功能受损第13周末,与正常对照组相比,模型对照组大鼠近端结肠组织紧密连接蛋白ZO-1、occludin的表达降低(p<0.01)；血浆二胺氧化酶的水平明显升高(p<0.01,p<0.05),提示2型糖尿病大鼠存在肠黏膜屏障功能受损。3、2型糖尿病大鼠血浆LPS及相关炎症因子水平升高,提示成功诱导“代谢性内毒素血症”第13周末,与正常对照组相比,模型对照组门静脉血浆脂多糖(LPS)的水平明显上升(p<0.01),血浆肿瘤坏死因子-α和白介素-6的表达均明显升高(p<0.01)。4、DPP-4酶抑制剂利格列汀对2型糖尿病大鼠糖脂水平、胰岛素抵抗及体重的影响第13周与正常对照组相比,模型对照组大鼠空腹血糖、空腹血浆胰岛素、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、血浆甘油三酯及总胆固醇等指标明显增高(p<0.01,p<0.05),胰岛素敏感指数(ISI)明显降低(p<0.01),体重也有明显增加(p<0.01)经过利格列汀4周的干预,与模型对照组相比,利格列汀干预组大鼠空腹血糖、空腹血浆胰岛素、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、血浆甘油三酯及总胆固醇等指标水平均显著降低(p<0.01),胰岛素敏感指数(ISI)明显升高(p<0.01)。但对体重无明显影响(p>0.05)。5、DPP-4酶抑制剂利格列汀对2型糖尿病大鼠肠黏膜屏障功能和代谢性内毒素血症的影响经过利格列汀4周的干预,与模型对照组相比,利格列汀干预组大鼠近端结肠组织紧密连接蛋白ZO-1、occludin的表达上升(p<0.01)；血浆二胺氧化酶的水平也有所降低(p<0.01)。大鼠门静脉血浆脂多糖(LPS)的水平下降(p<0.01),血浆肿瘤坏死因子-α和白介素-6的表达均有明显降低(p<0.01)。6、DPP-4酶抑制剂利格列汀改善2型糖尿病大鼠肠屏障功能的可能机制第13周末,与正常对照组相比,模型对照组大鼠近端结肠GLP-2的表达下降(p<0.01),PAR2的表达也有上升趋势(p<0.01)；经过利格列汀4周的干预,与模型对照组相比,利格列汀干预组大鼠近端结肠组织胰高血糖素样肽-2的表达上升(p<0.01), PAR2的表达有所下降(p<0.01)。研究结论：1、高脂饮食联合STZ成功制备了2型糖尿病大鼠模型。2、制备的2型糖尿病大鼠模型肠道紧密连接蛋白表达下降,肠黏膜屏障受损,可以很好的模拟2型糖尿病代谢性内毒素血症的发生。3、DPP-4酶抑制剂利格列汀可以上调2型糖尿病大鼠肠道紧密连接蛋白的表达,减轻肠黏膜损伤,从而改善代谢性内毒素血症,减轻系统性炎症反应。4、DPP-4酶抑制剂利格列汀修复2型糖尿病大鼠肠黏膜屏障和改善代谢性内毒血症的机制可能与其可以促进肠道GLP-2的产生,抑制PAR2的活化有关。