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研究目的:蛋白泛素化修饰是控制细胞内多种信号通路的关键调控机制之一。除了经典的七种泛素化修饰类型(K6/K11/K27/K29/K33/K48/K63),近年来鉴定的线性泛素化(Linearubiquitination)修饰因其重要的信号调节作用引起人们的极大关注。目前研究表明,线性泛素化修饰在炎症、凋亡等信号通路中发挥着重要作用。然而,线性泛素化如何调控抗病毒免疫信号通路尚有待深入探究。本课题旨在研究线性泛素化修饰对于干扰素(Interferon,IFN)介导的信号通路和抗病毒功能的影响,并深入阐明其具体的调控机制;同时,本课题将探讨病毒感染对线性泛素化修饰的调控;最后,我们将通过敲基因小鼠确证线性泛素化修饰对于体内IFN信号的调控意义。研究方法:(1)通过质谱技术鉴定Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)信号通路中关键蛋白STAT1的潜在相互作用蛋白;采用Western Blot方法分析线性泛素E3连接酶复合物LUBAC(HOIP/HOIL-1 L/Sharpin)对STAT1蛋白泛素化修饰的影响。(2)利用LUBAC过表达质粒或HOIP敲低质粒转染细胞,然后用IFN-Ⅰ刺激细胞,采用RT-qPCR或Western Blot方法,分析IFN-Ⅰ信号通路中关键蛋白的磷酸化;分析 IFN 刺激基因(Interferon-stimulated genes,ISGs)mRNA 表达水平的变化;检测细胞水平LUBAC对IFN-Ⅰ抗病毒能力的影响。(3)通过点突变技术,构建一系列STAT1赖氨酸位点突变体,确定STAT1发生线性泛素化修饰的关键位点;通过Western Blot或RT-qPCR方法,分析STAT1线性泛素位点突变体对IFN-Ⅰ信号通路的影响。(4)通过免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验,分析STAT1线性泛素化修饰对IFN-Ⅰ信号蛋白之间相互作用的影响,揭示STAT1线性泛素化修饰对IFN-Ⅰ信号通路调控的具体作用机制。(5)利用IFN-Ⅰ刺激细胞,通过Western Blot方法,分析IFN-Ⅰ信号对STAT1线性泛素化修饰的影响;进一步阐明IFN-I如何精细调控STAT1的线性泛素化修饰,明确其作用的分子机制。(6)通过细胞水平的病毒感染实验,探究HOIP在病毒感染情况下的表达变化;研究病毒感染对STAT1线性泛素化修饰的调控,以及这一调控对IFN-Ⅰ抗病毒信号的影响。(7)通过小鼠体内实验,确证线性泛素化修饰对IFN-Ⅰ信号和抗病毒功能的调控意义。研究成果:(1)发现STAT1与HOIP存在相互作用。LUBAC过表达显著上调STAT1的线性泛素化修饰;当HOIP蛋白被敲低时,STAT1的线性泛素化水平显著降低。(2)揭示了线性泛素化修饰抑制了 STAT1的磷酸化活化,并且维持了细胞内IFN-Ⅰ信号的稳态。(3)确定STAT1的K511和K652位点为STAT1线性泛素化修饰的关键位点;STAT1线性泛素化位点的突变促进了 IFN-Ⅰ信号中STAT1的磷酸化活化。(4)揭示了 STAT1的线性泛素化修饰抑制了 STAT1与IFNAR2的相互作用,从而抑制了 IFN-Ⅰ信号的激活。(5)发现IFN-Ⅰ信号利用OTULIN下调STAT1的线性泛素化,从而促进IFN-Ⅰ信号的快速激活。(6)发现多种病毒能够增加HOIP的mRNA和蛋白表达,进一步促进STAT1的线性泛素化修饰,从而抑制IFN-Ⅰ的抗病毒反应。(7)小鼠体内线性泛素化修饰的缺陷调节了 IFN-Ⅰ信号和抗病毒效能。研究结论:转录因子STAT1拥有线性泛素化修饰。线性泛素化修饰抑制了 STAT1与IFN-Ⅰ受体IFNAR2的相互作用,从而抑制了 STAT1的磷酸化水平,维持了IFN-STAT1信号的稳态。在IFN-Ⅰ信号中,STAT1的线性泛素化被OTULIN去除,从而使得STAT1能够被IFN-Ⅰ激活。病毒感染上调HOIP蛋白的表达,促进STAT1的线性泛素化修饰,抑制IFN-Ⅰ抗病毒信号,其中病毒上调HOIP表达依赖于NF-κB信号。综上,本课题揭示了线性泛素化修饰调控IFN-STAT1信号稳态和激活的关键机制。