研究背景和目的据国际糖尿病联盟统计,2011年全球糖尿病患病人数为3.66亿,预计2030年将达到5.52亿,相当于每十秒钟增加一名糖尿病患者。在我国,糖尿病患病率正处于激增阶段,近10年翻了近两倍,目前我国已成为全球第一糖尿病大国。糖尿病伴随极高的致残率和致死率,据统计每7秒钟就有1人因糖尿病死亡由于糖尿病可导致严重的血管并发症,患者的生活质量极差。糖尿病的防治迫在眉睫。糖尿病患者中90%以上属于2型糖尿病,经典理论认为,胰岛p细胞功能衰竭和胰岛素抵抗是2型糖尿病发病的关键环节,既往的研究也多集中于α,β等胰岛内分泌细胞,但最新的研究表明,胰岛微血管内皮细胞在糖尿病发病过程中也起到重要的作用。胰岛是高度血管化的组织,胰岛微血管内皮细胞是胰岛微血管的主要组分,衬覆于血管内壁,是机体与β细胞对话的“桥梁”。胰岛微血管内皮细胞与胰岛p细胞的关系密切：1.p细胞分泌VEGF-A促进胰岛微血管形成2.β细胞代谢产物调节胰岛微循环3.腴岛微血管内皮细胞参与p细胞的分化发育与增殖4.胰岛微血管内皮细胞供给胰岛β细胞营养物质和氧气5.胰岛微血管内皮细胞介导腴岛β细胞炎症反应。介于胰岛微血管内皮细胞在胰组织的生理学及病理学中的重要作用,内皮细胞极有可能是高糖损伤胰岛功能的靶标标之一。新近的研究发现,7周龄的糖尿病大鼠胰岛微血管内皮细胞增厚,内皮窗孔消失；12周龄时,微血管内皮细胞数目显著下降,出现内皮细胞破裂及胰岛内出血；15周龄时,胰岛微血管内皮细胞无法迁移,同时出现明显的导管细胞浸润现象,提示高糖对胰岛微血管内皮细胞具有损伤作用及致凋亡作用。胰岛微血.管内皮细胞凋亡可能参与了糖尿病的发生、发展过程,但高糖导致胰岛微血管内皮凋亡的具体机制尚未明确,有待进一步探索。糖尿病是一种以慢性高血糖为特征的代谢性疾病。既往研究报道适量的氧化氮(NO)足维持血管正常收收缩、舒张功能的关键因子,但在高糖环境内皮细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达升高,进而引起过量NO生成,NO进一步氧化生成过氧化亚硝酸盐产物,造成内皮细胞氧化应激,最终导致凋亡。高血糖可以通过氧化应激激活JNK通路、Akt通路引起大血管内皮及微血管内皮细胞凋亡,但对于胰岛微血管内皮细胞的研究比较匱乏。最近有研究报道高糖可以引起人胰岛微血内皮细胞凋亡,而用普伐他汀干预可以通过调节P13K/Akt通路减少内皮凋亡,进而改善血管功能。2012年,这个研究小组又报道了exendin-4可以通过PI3K/Akt、ERK1/2及cAMP/PKA等抗凋亡途径,减少人胰岛微血管内皮细胞在高糖刺激下的凋亡。高血糖引起的内皮细胞凋亡涉及多种机制,其相关凋亡通路主要为促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路。MAPK家族包括4个家族成员：细胞外信号调节激酶1/2(FRK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(JNK),p38和ERK5,他们在各种不同的刺激下激活,参与细胞的增殖、分化、凋亡等生理及病理过程。此前的研究表明,高血糖引起的内皮细胞凋记亡与JNK的激活密切相关。然而,该分子途径是否参与高血糖引起的胰岛微血内皮细胞凋亡尚不明确。本课题拟围绕高糖致胰岛微血内皮细胞凋亡展开研究,研究目的包括：1.以小鼠胰岛微血管内皮细胞(MS-1细胞)为研究对角,探讨高糖对胰岛微血管内皮细胞凋亡的影响。2.使用JNK抑制剂、iNOS抑制剂干预胰岛微血内皮细胞,探讨高糖引起胰岛微血管内皮细胞调亡分子机制。研究方法1.细胞培养、分组MS-1细胞(小鼠胰岛微血管内皮细胞)用正常浓度葡萄糖(5.5mmol/l葡萄糖)、甘露醇(5.5mmol/l葡萄糖+24.5mmol/l甘露醇)或高糖(30mmol/l葡萄糖)刺激7天。按需要加入SP600125(JNK抑制剂,30μmol/l)或1400W(iNOS抑制剂,20μmol/l)预刺激1小时,再进行高糖刺激。2. Hoechst33258染色将细胞培养在24孔板内,刺激结束后用Hoechst33258染色,共聚焦显微镜下观察凋亡细胞核的改变,并测凋亡率。3.流式细胞仪检测凋亡将细胞培养在6孔板内,刺激结束后使用annexin-V-PI染色,使用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。4. Caspase-3活性检测使用Caspase-3活性检测试剂盒,严格按照试剂盒步骤进行。5.ROS及O2-的检测ROS将细胞培养在24孔板内,刺激结束后用DCFH-DA孵育,共聚焦显微镜拍照,通过荧光相对强度评价细胞内ROS的水平。02-将细胞培养在24孔板内,刺激结束后用dihydroethidium (O2一的荧光探针)孵育,共聚焦显微镜拍照,通过荧光相对强度评价细胞内O2-的水平。6.免疫荧光染色细胞种植在圆形玻片上,刺激组束后,用4%多聚甲醛固定,0.03%TritonX-100透膜,10%胎牛血清封闭,一抗过夜后加入二抗。共聚焦显微镜下立即观察、拍照。7. Western blot细胞刺激结束后提取蛋白,上样后跑胶,牛奶封闭,一抗孵育过夜,二抗后加入显影剂显影、定影。8.NO的测定使用总NO检测试剂盒,严格按照试剂盒步骤进行。研究结果1.抑制.JNK或iNOS可以减少高糖引起的MS-1细胞凋亡流式细胞仪及Hoechst33258染色检测显示,高糖组的细胞凋亡率与正常糖组相比有显著性差异；而渗透压对照组与正常糖组相比无显著性差异。使用JNK抑制剂SP600125(30μmol/l)和iNOS抑制剂1400W(20μmol/l)干预高糖下的MS-1细胞,SP600125及1400W可以显著降低高糖引起的MS-1细胞凋亡。2.抑制JNK或iNOS可以减少高糖刺激下MS-1细胞iNOS蛋白的表达,减少NO、氧化亚硝酸盐的生成Western blot及细胞免疫荧光染色显示高糖组与正常糖组相比较,iNOS蛋白的表达及氧化亚硝酸盐生成显著升高。SP600125干预或1400W干预均可使高糖刺激下iNOS蛋白的表达显著下降,同时氧化亚硝酸盐生成显著减少。检测各组细胞培养基中的总NO生成量。结果显示NO的生成呈时间依赖性,在48h时,高糖组与正常糖组相比有显著差异。同时,SP600125干预组及1400W干预颅组的NO生成量与iNOS表达量相一致,与高糖组相比均有显著性差异。3.高糖可以增加MS-1细胞中ROS及02-的产生与正常糖组相比较,高糖可以显著增加MS-1细胞中ROS及02-的产生但渗透压对照组无明显差异。4.抑制JNK通路可以通过下调iNOS的表达减少高糖下MS-1细胞的凋亡Western blot及细胞免疫荧光染色显示在高糖刺激下,MS-1细胞中的P-JNK蛋白水平显著增高,但T-JNK蛋白水平无明显变化。SP600125及1400W可以显著减少JNK的磷酸化以及MS-1细胞的凋亡5.高糖通过激活JNK通路调节bax、bal-2的蛋白表达Western blot显示高糖下MS-1细胞中bax蛋白表达显著增加,但bcl-2蛋白表达水平没有明显的改变。bax蛋白表达的增加可以被SP600125所抑制。此外高糖刺激下bax与bcl-2的比值显著升高,但可以被SP600125所抑制。6.高糖通过激活JNK通路调节cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白表达Western blot结果显示高糖下cleaved caspase-3蛋白和cleaved PARP蛋白表达显著升高。而JNK的抑制剂SP600125可以通过抑制JNK通路的激活而抑制这种改变。研究结论1.高糖可以导致MS-1细胞凋亡2.高糖通过活性氮自由基(RNS)启动内源性凋亡途径引起MS-1细胞凋亡。3.JNK通路参与调控高糖-RNS导致的MS-1细胞凋亡。研究意义通过本研究,我们发现高糖对胰岛微血管内皮细胞(MS-1)存在致凋亡作用。通过抑制JNK通路,可以显著降低高糖下胰岛微血管内皮细胞的凋亡率改善了胰岛微血管的结构和功能,间接改善胰岛的营养物质、氧气的供应,更好的完成机体与胰岛对话的“桥梁”作用。介于胰岛微血管内皮细胞在胰岛组织的生理学及病理学中的重要作用,内皮细胞极有可能是高粮损伤胰岛功能的靶标之一,我们的研究结果为寻找改善胰岛微循环,乃至改善胰岛功能的切入点提供了新的方向和依据。研究背景和目的在糖尿病早期小鼠、肥胖小鼠及妊娠小鼠体内,由于胰岛素需求量增大,β细胞会相应的增生,但在糖尿病的后期β细胞数目进行性下降。无论1型还是2型糖尿病,由于β细胞数量的减少及功能丧失,患者体内的胰岛素水平都处于绝对或者相对不足的状态。研究发现,β细胞的再生能力与年龄相关,随着年龄的增大β细胞的再生能力会逐渐下降。在杨文英教授主持的2007—2008年中国糖尿病患病率调查中发现,糖尿病的患病率随着年龄的增加而显著增加(20岁-39岁,40岁-59岁,≥60岁的糖尿病患商病率分别为3.2%,11.5%,20.4%)。以上说明,年龄是影响β细胞再生的关键因素。研究人员在多种动物模型中都发现,聚(ADP-核糖)聚合酶-1(Poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1)参与多种生理过程,包括β细胞的死亡和再生。PARP-1基因敲除小鼠(PARP-1-/-小鼠)由于PARP-1基因的缺失,可以使β细胞避免STZ对造成损伤,从而避免诱发糖尿病。同时发现PARP-1基因过表达参与β细胞的死亡。将大鼠的胰腺部分切除,再给予大鼠PARP-1的抑制剂,可以观察到β细胞再生,PARP-1抑制剂的这种作用可能通过增加再生基因(regenerating gene, Reg)的转录实现。Reg基因表达广泛,在胰腺、肝脏、消化系统都有表达,参与相应组织的分化与再生过程。Reg蛋白在β细胞的再生、存活中起着重要的作用,并在一定程度上可以刺激β细胞的生长。年龄相关的β细胞再生的机制还不明确。在本研究中,我们以2月龄、12月龄C57BL/6J小鼠及PARP-1-/-、鼠为研究对象,并使用了小剂量的STZ腹腔注射刺激β细胞适应性再生,对年龄相关胰岛β细胞再生的机制进行探索本课题拟围绕年龄相关胰岛β细胞再生展开研究,研究目的包括：1.探讨年龄对胰岛β细胞基础再生能力及适应性再生能力的影响。2.探年龄相关胰岛β细胞基础再生能力及应性再生能力的相关机制。研究方法1.实验动物雄性C57BL/6J野生型(Wild-type, WT)小鼠及PARP-1-/-小鼠,4-5周龄,购自Jackson实验室。动物分组：A组：2月龄C57BL/6J小鼠B组：2月龄C57BL/6J小鼠+STZC组：2月龄PARP-1-/-小鼠D组：2月龄PARP-1-/-小鼠+STZE组：12月龄C57BL/6J小鼠F组：12月龄C57BL/6J小鼠+STZG组：12月龄PARP-1-/-小鼠H组：12月龄PARP-1-/小鼠+STZ2.小剂量STZ的注射小鼠腹腔注射小剂量STZ(90mg/kg),之后给予含有BrdU (1mg/mL)的饮用水饮用,直至14天后处死取材。对小鼠进行小剂量STZ腹腔注射,可以显著诱导β细胞适应性再生,这种方法耐受性好,不会导致小鼠糖尿病,是公认的研究β细胞再生能力的方法。3.免疫荧光染色及HE染色石蜡切片脱蜡至水,抗原修复,封闭,一抗孵育(胰岛素、胰高血糖素、BrdU、RegⅠ、Reg Ⅱ、Reg Ⅳ)置湿盒中4℃孵育过夜,二抗孵育。石蜡切片脱蜡至水,HE染色观察胰岛形态。4.β细胞增殖分析对胰腺切片进行免疫荧光染色(三标：DAPⅠ/胰岛素/BrdU),三种抗体均为阳性的为新增殖的β细胞,DAPI/胰岛素染色阳性的为总β细胞。β细胞增殖率=(DAPI/胰岛素/BrdU阳性细胞数)/(DAPI/胰岛素阳性细胞数)×100%。5.β细胞质量分析取材后立即对每个胰腺组织进行称量,之后进行组织固定、石蜡包埋、切片。对胰腺切片进行免疫荧光染色(三标：DAPI/胰岛索/胰高血糖素),以区别α细胞与β细胞。共聚焦显微镜进行观察,拍照,使用Adobe Photoshop软件分析每个胰岛中β细胞的横截面积,计算出胰腺整个截面β细胞所占的总面积。β细胞质量=(β细胞所占的总面积/胰腺面积)×胰腺质量。6.葡萄糖耐量试验及胰岛素释放试验(1)葡萄糖耐量试验：按照2g/kg体重的剂量,给予小鼠葡萄糖溶液腹腔注射,然后分别在注射葡萄糖溶液0分钟、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟测定小鼠的血糖水平(2)胰岛素释放试验：按照2g/kg体重的剂量,给予小鼠葡萄糖溶液腹腔注射,然后分别在注射葡萄糖溶液0分钟、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟测定小鼠的血清胰岛素水平7.PARP-1的活性检测胰岛的PARP-1活性使用PARP-1活性比色法定量检测试剂盒进行检测,按说明书进行操作。8.Western Blot检测蛋白水平：检测cleaved PARP-1、RegⅠ、Reg Ⅱ和RegIV的蛋白水平捉取胰岛,方法参照文献[schen SI.2009Diabetes.58:1312-20,备用。其余步聚同论文Ⅰ材料和方法部分。研究结果1.PARP-1对小鼠葡萄糖稳态的影响葡萄糖耐量试验显示：12月龄WT小鼠血L糖水平明显高于同龄PARP-1-/-小鼠血糖水平。胰岛素释放试验结果显示：12月龄PARP-1-/-小鼠胰岛素释放量显著高于同龄的WT小鼠。空腹血糖及空腹胰岛素水平在2月龄WT小鼠与同龄PARP-1-/-小鼠之间无明显差异,但在12月龄WT小鼠与同龄PARP-1-/-小鼠之间有显著差异。我们运用了单次小剂量的STZ腹腔注射,诱导p细胞适应性再生,进一步明确PARP-1在年龄相关的糖代谢中的作用。葡萄糖耐量试验显示：在不同的时间点,12月龄WT小鼠血糖水平明显高于同龄PARP-1-/-小鼠血糖水平。胰岛素释放试验结果显示：12月龄PARP-1-/-小鼠胰岛素释放量显著高于同龄的WT小鼠。而在2月龄小鼠中,胰岛素释放曲线无显著差异。STZ腹腔注射造模后,除外12月龄PARP-1-/-小鼠,其余各组小鼠空腹血糖水平较未注射前升高,空腹胰岛素水平较未注射前降低。与未注射STZ的结果相似,空腹血糖及空腹胰岛素水平在12月龄WT小鼠与同龄]PARP-1-/-小鼠之间有显著差异。2.PARP.1对胰岛体积的影响2月龄的小鼠无论WT小鼠还是PARP-1-/-小鼠,大部分的胰岛体积较小(<2,000μm2),只有很少的一部分胰岛体积较大。在12月龄的小鼠中胰岛体积明显增大(>10,000μm2)。在注射STZ后,2月龄的WT小鼠、2月龄PARP-1-/-小鼠及12月龄PARP-1-/-、鼠的胰岛体积无明显改变,12月龄的WT小鼠的胰岛体积显著的减小。3.PARP-1对p细胞质量的影响注射STZ前后,2月龄的WT小鼠和同龄PARP-1-/-小鼠β细胞的面积没有显著的差异。不同于此,注射STZ前,12月龄的WT小鼠和同龄PARP-1-/-小鼠β细胞的面积没有显著的差异；注射STZ后,PARP-1-/-小鼠β细胞的面积明显大于同龄WT小鼠的。同时,汁射STZ前后,各组胰腺的质量无明显改变,再根据β细胞的而积,从而计算出β细胞的质量,各组结果与面积的结果相似。4. PARP-1对β细胞再生能力的影响用BrdU的染色来观察β细胞的再生能力,细胞核BrdU染色阳性的为新增殖的细胞。注射STZ前,2月龄的WT小鼠和同龄PARP-1-/-小鼠胰岛组织中新增殖的β细胞无明显差异。然而,123月龄的PARP-1-/-小鼠胰岛组织中新增殖的β细胞数显著高于同龄WT小鼠的细胞数。注射STZ后,可以看到相似的结果。5. PARP-1的蛋白表达及活性检测Western blot及PARP-1活性比色试剂盒的结果显示：注射STZ前后,12月龄WT小鼠的胰岛cleaved PARP-1蛋白表达水平比2月龄WT小鼠的显著增高、活性增强。6. RegⅠ、RegⅡ及RegⅣ在各组小鼠胰腺中的蛋白表达免疫荧光染色、Western blot显示：在注射了STZ后,各组小鼠胰腺中的RegⅠ及RegⅡ农达增加。STZ注射前后,2月龄小鼠两组之间胰腺的RegⅠ及RegⅡ的表达无显著差别,而12月龄组PARP-1-/-小鼠较WT小鼠胰腺的RegⅠ及RegⅡ表达增高。RegⅣ在各组小鼠的胰岛组织中都有高表达。是否注射STZ,对胰腺RegⅣ的表达无明显的影响研究结论1.随年龄增加,小鼠β细胞的基础再生能力及适应性再生能力均呈下降趋执。2. PAPR-1通过调控Reg家族蛋白的表达,影响年龄相关的β细胞再生过程。研究意义我们的研究说明PAPR-1通过调控Reg家族蛋白的表达,影响年龄相关的p细胞再生过程。这一发现为寻找改善老龄患者β细胞再生能力的方法提供了新思路,并且为从根本上解决糖尿病患者胰岛β细胞数量不足的难题提供了新方向,使延缓2型糖尿病的发生、发展成为了可能。