【摘 要】
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番茄（Solanum lycopersicum）为双子叶植物,属管状花目,茄科,是一种重要的经济作物。SPL基因编码一类植物特异性转录因子,在植物生长和发育中起着至关重要的作用。SPL8是拟南芥第一个被报道具有功能的SPL基因,缺失SPL8基因造成拟南芥半不育的表型,主要是由于花药发育异常。SPL8的这一功能在番茄中是否保守?尚不清楚。利用分子生物学技术分离番茄SPL8基因并研究其功能,将为开发利
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番茄（Solanum lycopersicum）为双子叶植物,属管状花目,茄科,是一种重要的经济作物。SPL基因编码一类植物特异性转录因子,在植物生长和发育中起着至关重要的作用。SPL8是拟南芥第一个被报道具有功能的SPL基因,缺失SPL8基因造成拟南芥半不育的表型,主要是由于花药发育异常。SPL8的这一功能在番茄中是否保守?尚不清楚。利用分子生物学技术分离番茄SPL8基因并研究其功能,将为开发利用SPL8基因提供理论依据和实践指导。本研究通过分离克隆番茄中的两个SPL8基因及其启动子:SlySPL8a、SlySPL8b、p SlySPL8a和p SlySPL8b,分析其表达模式,并进行亚细胞定位;应用CRISPR/Cas9技术在番茄基因组中敲除SlySPL8a和SlySPL8b基因,分别构建Slyspl8a和Slyspl8b单突变和Slyspl8a Slyspl8b双突变植株。主要结果如下:1.SlySPL8基因其及启动子生物信息学分析结果显示,SlySPL8a和SlySPL8b基因分别编码293和299个氨基酸,多重序列比对表明,它们均含有SBP-BOX保守结构域和3个外显子。2.利用PCR技术扩增番茄中的两个SPL8基因编码区和它们的启动子:SlySPL8a、SlySPL8b、p SlySPL8a和p SlySPL8b,序列全长分别为882 bp、900 bp和3000 bp、3000 bp。利用RT-PCR分析SlySPL8a和SlySPL8b基因在不同组织器官中的表达模式,结果显示:两个基因在营养器官茎、叶中表达量较低,在根中不表达;在花萼、未成熟的花药、雌蕊中表达,尤其在绿果中表达最高。但在花瓣、成熟的花药、花序和成熟的红果不表达。亚细胞定位结果显示:SlySPL8b-GFP蛋白定位于细胞核,但SlySPL8a-GFP没有获得转基因植物。p SlySPL8b::GUS植株染色结果显示,SlySPL8b启动子的活性在叶片和雌蕊的柱头上。3.构建番茄SlySPL8a和SlySPL8b的CRISPR/Cas9敲除载体,以及两个基因同时敲除的载体。由于未知原因只获得了Slyspl8a突变体植株,无法获得Slyspl8b单突变体和Slyspl8a Slyspl8b双突变体植株。推测可能的原因是:SlySPL8b突变可能导致番茄植株无法正常生长发育,致死。对T1突变体进行测序分析发现:其中8a,21a,27a植株未发生突变;13a,11a,22a,14a属于杂合突变;4a,19a,6a属于纯和突变;2a,17a,15a,9a,26a属于双等位突变,即两条同源染色体均发生突变,且突变类型类型不一样。对T2代植株测序发现9a-1是杂合突变;15a-2,17a-1,17a-2,26a-2,26a-3,26a-4均是纯和突变;9a-2,9a-5,26a-1,15a-3均是双等位突变。在T2代植株表型分析过程中,虽然发现多数突变体植株都存在侧枝增多,发育矮小的表型。但目前还无法确定这一表型是否与SlySPL8a基因有关,仍需要时间继续进行突变体的纯化和确认。这些研究结果为深入解析番茄SlySPL8基因的功能和进一步开发利用SlySPL8提供了基础资料。
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