飞蝗是全球范围内一种典型的爆发性农业害虫,蝗灾的爆发限制了农业的稳定发展。长期以来,对飞蝗的防治措施主要以使用化学农药为主,但是化学农药的长期大量使用造成了严重的“3R问题”,所以,发展飞蝗绿色防控新方法已经迫在眉睫。绿僵菌（Metarhizium anisopliae）被应用于农林害虫的防治,但因其见效缓慢,阻碍了其作为生物防治重要资源的产业化进程。虫生真菌之所以杀虫效率低,是因为当其侵染时,受到害虫先天免疫系统的抵抗。因此,开展对害虫免疫系统的研究,挖掘免疫虫生真菌的关键基因,并以此基因为靶点,研发新型、安全高效的生物杀虫制剂对于提高生物防治效率具有重要意义。基于此,本论文的主要研究内容为:在前期获得飞蝗免疫绿僵菌的关键基因Toll-like receptor（TLR）的基础上,克隆TLR基因c DNA全长序列并对其结构进行分析,构建系统发育树;分析免疫关键基因TLR的表达模式及绿僵菌对其的诱导表达模式;研究TLR在免疫绿僵菌中的功能;构建表达具有发卡结构dsTLR的重组绿僵菌并进行毒力测定。本文主要研究结果如下:1.在已从转录组数据库中获得飞蝗TLR部分序列的基础上,通过RACE结合RT-PCR技术获得TLR基因的cDNA全长序列,其中ORF为3387 bp,其蛋白的分子量（MW）约为127.8KDa,等电点（PI）为5.88。通过生物信息学分析发现LmTLR是一个Ⅰ型跨膜受体,分为膜内部分和膜外部分。膜内的TIR结构域与白介素-1受体（Interleukin-1 receptor,IL-1R）高度同源,膜外部分由重复的亮氨酸组成。运用荧光定量PCR对飞蝗LmTLR的时空表达模式进行分析,结果表明LmTLR在表皮中表达量最高,同时,LmTLR在3龄、4龄和5龄的表达量最高。通过系统发育进化分析发现,飞蝗与双斑蟋（Gryllus bimaculatus）亲缘关系较近。2.通过qRT-PCR检测了真菌及细菌对LmTLR的诱导表达模式,结果表明细菌和真菌都可以诱导飞蝗LmTLR的表达;为了进一步明确LmTLR在免疫反应中的功能,利用RNA干扰技术沉默LmTLR,研究发现注射dsRNA 24小时后,LmTLR可以被显著沉默,干扰LmTLR后,飞蝗血淋巴的抗菌活性显著下降,Toll信号关键基因LmMy D88和LmPelle的表达量也随之下调,表明LmTLR通过影响Toll通路上的两个关键基因LmMy D88和LmPelle的表达而调控免疫反应;此外,我们还发现沉默LmTLR也能够影响转铁蛋白Lmtransferrin的表达。3.利用内外源蜕皮激素诱导以及干扰蜕皮激素受体Ec R研究LmTLR的表达调控模式,结果表明内外源20E均能诱导LmTLR的表达,LmTLR在5龄期的表达水平变化与飞蝗体内蜕皮激素滴度的变化趋势一致。沉默Ec R后,内外源蜕皮激素均不能诱导LmTLR的表达。这说明了20E通过结合蜕皮激素受体（LmEcR）来调控LmTLR的表达。4.为了能够提高绿僵菌的致病效率,本文构建了表达dsLmTLR的载体pSilent-1-TLR1-TLR2,并将载体成功导入绿僵菌原生质体中,使其能够表达dsLmTLR。实验结果表明:转基因绿僵菌可以表达并分泌dsLmTLR,通过qRT-PCR检测发现,转基因绿僵菌可以显著降低飞蝗LmTLR的表达水平（沉默了约81%）;转基因绿僵菌的毒力水平显著高于原始菌株,飞蝗全部死亡时间提前约2天,大幅增加了绿僵菌的杀虫效率。本研究论文应用分子生物学技术方法解析了飞蝗TLR在免疫绿僵菌种的功能,揭示了飞蝗TLR的激素调控模式,并成功构建表达dsLmTLR的高致病力绿僵菌工程菌株,研究结果对于提高生物防治效率,促进虫生真菌作为高效绿色杀虫剂的产业化进程具有重要意义。