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背景：帕金森病(Parkinsons disease，PD)是临床上常见的神经退行性疾病之一。PD的临床表现主要为静止性震颤、运动迟缓、步态异常和肌强直，PD的病因与发病机制尚无确切定论，主流研究认为这是一种与衰老、环境及遗传因素密切相关的疾病。PINK1基因(PTEN-induced putative kinase1)是在2004年被克隆的PARK6致病基因，属于常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征的致病基因之一，该基因编码产生一种由581个氨基酸组成有激酶活性的线粒体蛋白，包括一个由34个氨基酸组成的线粒体定位结构域和一个由354个氨基酸组成的激酶结构域，此激酶结构域与Ca2+/钙调蛋白家族的丝氨酸/苏氨酸激酶高度同源。PINK1蛋自首先于2003年被证明它的激酶区域在体外实验中有自磷酸化活性，PINK1蛋白能通过自身磷酸化后，调节其自身的激酶活性;PINK1蛋白也能参与体外磷酸化，如磷酸化组蛋白H1或酪蛋白。有研究发现PINK1基因的致病突变影响了PINK1蛋白的磷酸化。但未有PINK1蛋白自身磷酸化位点体外实验的鉴定研究报道，及PINK1蛋白的自身磷酸化修饰位点改变对其体外激酶活性影响研究报道。在前期工作中我们发现了两种PINK1基因新的纯合致病突变(T313M，R492X)，两者均位于激酶结构域中，从而导致其激酶功能改变，也可能对稳定PINK1蛋白的结构起重要作用，这两种致病突变的致病机理仍有待探讨。 目的：探讨PINK1蛋白自磷酸化修饰功能及磷酸化底物功能参与帕金森病致病的机制 方法：⑴应用谷胱甘肽亲和层析法纯化法、体外磷酸化和质谱技术鉴定PINK1蛋白的自身磷酸化修饰位点;⑵应用体外磷酸化和放射自显影技术明确PINK1蛋白的自磷酸化修饰位点;⑶应用体外磷酸化和放射自显影技术检测PINK1的自磷酸化修饰位点突变、T313M、R492X突变对PINK1蛋白的激酶活性的影响;⑷应用脂质体过表达、细胞免疫荧光化学染色的方法检测自磷酸化修饰位点对PINK1在真核细胞中的亚细胞定位的影响;⑸应用脂质体过表达、chase-time技术研究自磷酸化位点突变对PINK1自身降解的影响;⑹应用脂质体过表达、细胞免疫荧光化学染色的方法检测PINK1自磷酸化修饰位点突变、T313M、R492X突变PINK1对Parkin亚细胞定位的影响。 结果：①质谱结果显示一个PINK1蛋白可能的自身磷酸化位点:PINK1第465位丝氨酸残基-Ser465，通过生物信息比对可知，该氨基酸残基在绝大多数种属中高度保守。②放射自显影结果示:在体外磷酸化条件下，野生型PINK1蛋白能够被自身磷酸化，而S465A突变型PINK1蛋白自身磷酸化水平较野生型降低，两者的差异具有统计学意义(P＜0.05)。③放射自显影结果示:在体外磷酸化条件下，野生型PINK1蛋白能够磷酸化酪蛋白(casein)，而T313M、R492X、S465A突变型PINK1蛋白磷酸化底物水平较野生型降低，三种突变型PINK1蛋白分别与野生型PINK1蛋白进行两两比较的差异均具有统计学意义(P＜0.05)。④HEK293细胞免疫荧光化学染色结果显示:野生型PINK1蛋白分布于细胞胞质，呈典型的点状分布的线粒体定位;而S465A、S465D突变型PINK1蛋白的亚细胞定位没有明显变化，仍呈胞浆中线粒体定位。⑤Chase-time实验结果显示:S465A、S465D突变型PINK1蛋白降解的半衰期较野生型延长，降解减慢。⑥HEK293细胞免疫荧光化学染色结果显示:野生型PINK1蛋白和S465D突变型PINK1蛋白均促进Parkin蛋白转移到聚集的线粒体上，S465A、T313M、R492X突变型PINK1蛋白促进此过程的效率明显下降。 结论：⑴PINK1蛋白第465位丝氨酸残基Ser465为其体外自磷酸化的位点之一;⑵PINK1蛋白第465位丝氨酸残基Ser465突变、PINK1致病突变T313M、R492X均能引起PINK1体外磷酸化激酶活性降低;⑶PINK1蛋白第465位丝氨酸残基Ser465对PINK1蛋白真核细胞内亚细胞定位无影响;⑷PINK1蛋白第465位丝氨酸残基Ser465与PINK1蛋白在真核细胞内自身稳定性相关;⑸PINK1蛋白第465位丝氨酸残基Ser465能调节真核细胞内PINK1蛋白与Parkin蛋白的线粒体共定位;⑹PINK1致病突变T313M、R492X均能引起真核细胞内PINK1蛋白与Parkin蛋白的线粒体共定位的效率降低。