原发性肝癌在世界范围流行较广泛，是严重影响我国人民健康的疾病之一。尽管近半个世纪以来我国在肝癌的临床治疗方面积累了丰富的经验，基础研究水平取得长足的进步，但远未达到控制该病的程度；肝癌对常规的放疗、化疗方法不敏感，近年来多倾向于以手术为主的综合治疗，但手术治疗仅对一部分肝癌患者适用，因此亟需寻求新的治疗方法。 肿瘤细胞异常表达的分化抗原、激素和生长因子受体以及某些病毒抗原是导向治疗的依据，因此出现应用于体内外导向治疗各种特异性抗体、重组激素、生长因子及病毒相关性糖蛋白受体等。基因工程抗体技术在恶性肿瘤的诊断、导向治疗方面的应用，取得了令人鼓舞的成果，肿瘤的导向治疗已经成为继手术治疗、放疗、化疗三大常规治疗之后，又一类新的治疗手段——生物治疗的重要组成部分。采用基因工程手段制备的肿瘤特异性单链抗体等小分子抗体的问世，为解决肿瘤治疗的靶向性提供了新的手段，成为肿瘤 第四军医大学硕士学位论文一导向治疗中的热点；重组免疫毒素采用抗体片段或其他具有特异性导向作用的细胞因于等，与细菌或植物毒素结合组成，是一类新型的有较高抗肿瘤特异性的生物制剂，在诸多有关肿瘤治疗的基础研究领域以及临床实验中取得较好的结果。 抗体技术及融合蛋臼技术在肿瘤治疗方面不断取得进展，但抗肝癌单链抗体与毒素融合蛋白治疗肝癌的尝试较少；因此，为了探讨重组免疫毒素在肝癌的导向治疗中的作用，本研究采用基因工程技术，将人源化抗肝癌单链抗体hSCFV基因及改构型绿脓杆菌外毒素PE38基因重组，构建原核表达载体PGEX4TlhSCFV－PE38（PGEXh—PE38），研究其在大肠杆菌JM109中的诱导＄达情况及表达条件，对诱导产物纯化后，得到抗肝癌免疫毒素hscFv－PE38，初步研究其对人肝癌细胞系SMMC－7721的生长抑制作用，制备出具有一定临床应用溶能的特异性抗肝癌免疫毒素，为今后肝癌的临床导向治疗研究打下基础。实验方法和结果如下： 实验采用PCR的方法成功扩增PE38基因片段，并在PE38的两端加上所需要的酶切位点，PE38基因5’端与hscFv基因3’端连接，构建原核表达载体pGEX4T－lhSCFV－PE38（pGEXh—PE38），重组表达载体及PCR扩增的PE38基因通过基因测序证实无突变，PE38基因与hscFv基因由CTTAAGAAA九个碱基对连接；PGEXh—PE38转化感受态N109，受IPTG诱导之后，成功表达预期的GST融合蛋白，分子量为90kD，在不同浓度IPTG诱导条件下最大表达量占细菌总蛋白的9％一 if％，表达产物以包涵体形式存在；包涵体经变性、复性、重折叠，经GST亲和层析柱层析纯化，凝血酶切割、进一步纯化后，得到纯化的hscFV－PE38抗肝癌兔疫毒素，分子量为66kD，纯度达到实验要求。 为进一步研究hsCFv－PE38融合蛋白的活性，实验在设置严格对照的条件下，了解其对人肝癌细胞系SMMC—7721及正常肝细胞系QZG的生长抑制作用，采用MTT法测定经不同浓度hSCFV－PE38处理后培养细胞的A4。。值。实验结果显 第一页 第四军医大学硕士学位论文一示，hSCFV－PE38融合蛋白对SMMC－7721细胞具有较好的杀伤效果，浓度与A490之间有较明显的相关，呈较好的剂量－效应关系（Pearon拟合优度检验，x‘＝8．844，V＝5，P＝0．115），最大抑制率为75％，而与正常肝细胞系不存在剂量一效应关系；SMMC－7721的存活率与浓度之间做Probit分析，方程为LositP＝－0．259－0．273In（x），ICS。为0．386u g／mL。 实验研究结论：①成功构建了人源化抗肝癌单链抗体hSCFV融合改构型绿脓杆菌外毒素PE38表达载体PGEXh—PE38；②完成该载体的诱导表达，并成功纯化了表达产物 hSCFy－PE38：＠重组免疫毒素对人肝癌细胞系SMMC－772的具有较强的生长抑制作用。以上结果提示通过基因重组技术，可大量表达并纯化具有生物活性的特异性兔疫毒素，为进一步肝癌的导向治疗研究提供了一条可行的途径。