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目的:微卫星高度不稳定（microsatellite instability-high,MSI-H）是一种发生在基因组微卫星上的超突变模式,其发生是由于肿瘤组织的DNA错配修复出现功能性缺陷导致,即错配修复缺陷（mismatch repair deficient,d MMR）。结直肠癌（colorectal cancer,CRC）起源于正常结肠上皮,基因组不稳定性是驱动其发生的关键因素,CRC中存在两种类型的基因组不稳定性,包括染色体不稳定性和微卫星不稳定性。MSI-H/d MMR在不同种类的癌症中均有发生,在结直肠癌中的发病率较高,约占整体15%和转移性CRC患者5%,这一亚型的患者是免疫检查点抑制剂（immune checkpoint blockade,ICB）治疗的优势人群。尽管如此,多项研究已经发现,ICB治疗MSI-H/d MMR型CRC患者的客观缓解率仅约40%,相当大部分患者对治疗无应答或不能从中持续获益,提示MSI-H/d MMR型CRC肿瘤具有异质性。因此,进一步对MSI-H/d MMR型CRC患者进行分层、挖掘其中免疫治疗获益人群的特征基因,并探索其作用机制对精准的ICB治疗至关重要。本研究拟针对这一关键科学问题,通过单细胞转录组测序数据挖掘MSI-H/d MMR型CRC的关键基因,并通过实验对其在ICB治疗中的作用及其潜在机制进行深入探讨。研究方法:1.应用R包bibliometrix分析文献计量数据,包括出版物的数量和被引次数、国际合作关系、国家和期刊贡献、高被引文献、高贡献期刊和历史直接引文网络等。2.Cite Space软件分析具有引文爆发特征的文献。3.VOSviewer用于文献计量网络数据的可视化,如关键词、主题词、作者和机构等,节点之间的链接代表了共现、耦合、合作等关系。4.本研究分析了单细胞转录组数据GSE144735,对数据进行了质量控制和批次效应校正。5.应用Seurat R包进行细胞聚类分析,应用t分布随机邻居嵌入法对细胞聚类进行可视化展示。6.通过Single R R包和Cell Marker数据库进行细胞类型的注释。7.利用Monocle 2进行结直肠癌上皮细胞的拟时序分析以推断肿瘤细胞的发生发展过程并分析拟时序轨迹中基因的表达变化。8.通过R包Seurat进行细胞亚群差异基因筛选。9.通过单样本基因富集分析（single sample GSEA）对每个细胞进行通路富集分析,通过Hallmark数据库基因集注释生物学功能。10.在GSE39582和GSE72970数据集中分析基因与各个临床病理学参数的关系。11.通过肿瘤纯度分析（Estimate）推断结直肠癌样本的肿瘤纯度。12.蛋白免疫印迹（Western blotting）实验用于检测蛋白表达水平。13.定量实时聚合酶链反应（q RT-PCR）检测m RNA表达水平。14.应用siRNA或c DNA质粒转染技术对目的基因进行敲减或过表达。15.通过慢病毒感染和药物筛选法构建稳转细胞系。16.应用密度梯度离心法从健康人外周血中提取外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）。17.在96孔板中共培养肿瘤细胞与PBMC,应用MTS法和倒置荧光显微镜检测肿瘤细胞存活率。18.通过流式细胞表面染色检测肿瘤细胞表面HLA-DR表达。19.R软件和Graph Pad Prism 9用于上述绘制分析,所有统计学检验均为双尾,P值＜0.05被认为具有统计学差异。结果:1.文献计量学研究部分纳入免疫检查点抑制剂PD-1、PD-L1分子相关文献11971篇,PD-1、PD-L1单抗的随机临床实验（randomized clinical trial,RCT）和荟萃分析分别为191篇和335篇。2.PD-1、PD-L1分子相关文献主要分成3个研究主题,用于预测PD-1、PD-L1单抗疗效的生物标志物包括MSI-H等是癌症与生存主题的重要组成部分。在PD-1、PD-L1单抗RCT中研究人员关注了治疗人群的选择,而荟萃分析中更关注与免疫相关不良反应和人口学特征对ICB疗效的影响。3.PD-1、PD-L1研究领域的重点已经从分子机制逐渐转向临床应用,包括免疫检查点抑制剂联合化疗、分子靶向治疗等策略。免疫治疗相关生物标志物如MSI-H、免疫治疗相关不良反应、PD-1和PD-L1单抗治疗的敏感性和耐药性以及肿瘤异质性是目前和未来的研究热点。4.结直肠癌上皮细胞的单细胞聚类分析提示了结直肠肿瘤细胞的多样性,本研究从中识别了左半结肠特异的肿瘤细胞亚群、混合的肿瘤细胞亚群、晚期肿瘤细胞亚群和MSI-H肿瘤细胞亚群等。5.拟时序分析发现在从左半结肠特异性细胞亚群发展至晚期肿瘤细胞的轨迹中,上皮间质转化和血管新生功能富集程度逐渐增加。6.MSI-H肿瘤细胞在拟时序轨迹中形成了独特的分支,并且沿轨迹MSI-H肿瘤细胞亚群免疫相关通路富集程度逐渐增加,如炎症反应、肿瘤坏死因子、干扰素应答等。7.ANXA10是免疫相关功能富集程度最高的MSI-H肿瘤细胞亚群的特征基因,ANXA10表达水平在MSI-H肿瘤分支中随轨迹逐渐增加。ANXA10在d MMR型肠癌、近端肠癌和右半结肠癌中高表达,并与对5-氟尿嘧啶（5-fluorocrail,5-FU）为基础的化疗反应较差有关（P＜0.05）。8.ANXA10在MSI-H肠癌细胞系HCT15中表达较高,在MSI-H肠癌细胞系HCT116和RKO中表达较低。9.ANXA10增加了PBMC作用下MSI-H肠癌细胞的存活率（P＜0.05）。10.ANXA10显著提高MSI-H肠癌细胞对PD-1单抗的敏感性（P＜0.001）。11.ANXA10显著增加MSI-H肠癌细胞表面HLA-DR表达阳性细胞比例（P＜0.01）,并促进HLA-DR二聚体的组成型和IFN-γ诱导型表达。12.ANXA10不能上调HLA-DRα和HLA-DRβ的m RNA表达。13.ANXA10敲减显著降低了MSI-H肠癌细胞系中CD74的m RNA（P＜0.01）和蛋白表达。结论:1.PD-1、PD-L1研究领域的重点已经从分子机制逐渐转向临床应用,免疫治疗相关生物标志物如MSI-H、肿瘤异质性、免疫治疗相关不良反应以及PD-1和PD-L1单抗治疗的敏感性和耐药性是目前和未来的研究热点。2.ANXA10是免疫相关功能富集程度最高的MSI-H肿瘤细胞亚群的特征基因,在d MMR肠癌中高表达,可能在该人群中发挥了重要的生物学功能。3.在MSI-H型肠癌细胞系中,ANXA10能够显著增加肿瘤细胞对PD-1单抗的敏感性。4.ANXA10在MSI-H肠癌细胞系中可能通过上调CD74表达,进而促进了细胞表面HLA-DR表达,最终提高了肿瘤细胞对PD-1单抗的敏感性。