白桦应拉木形成代谢组学分析及BpMYB4基因表达和功能分析

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MYB类转录因子家族是指含有MYB结构域的一类转录因子。这些转录因子广泛参与植物的各种发育和代谢的调节,如细胞分化、细胞周期的调节、激素和环境因子应答,并对植物次生代谢以及叶片等器官形态建成具有重要的调节作用。本文通过对白桦形成层相关组织的cDNA文库序列进行同源性比对,获得了AtMYB4的同源基因,命名为BpMYB4。本论文对其进行一系列研究:利用实时荧光定量PCR分析BpMYB4基因的组织表达特性。结果表明:BpMYB4基因在不同组织中均有表达,其中在花组织中的表达量最高,这与转录抑制因子的表达特性相似;BpMYB4基因在应力木形成中表达分析结果显示,应拉木中该基因表达量升高,初步认定BpMYB4是木质素生物合成的抑制因子。利用染色体步移法获得BpMYB4基因启动子,生物信息学分析发现该启动子中含有与细胞分裂素相关元件,与花药和花粉发育相关元件,赤霉素响应元件,Dof蛋白结合位点,参与冷冻胁迫和脱落酸响应的元件等;该启动子驱动GUS表达结果显示,该基因在白桦茎、叶柄和芽中表达,这与利用实时定量PCR进行的组织表达特性分析结果一致,推测白桦BpMYB4基因可能参与维管组织的发育。构建了白桦BpMYB4基因的过表达载体pROK Ⅱ-BpMYB4及抑制表达RNAi-BpMYB4,电击转化农杆菌,并对白桦组培苗进行瞬时侵染,实时定量PCR分析表明,过表达株系BpMYB4的表达量上调10倍;抑制表达株系BpMYB引的表达量下调28倍,说明构建的表达载体据有过表达和抑制表达功能。构建了融合载体pROKⅡ-BpMYB4-GFP,利用基因枪转化法轰击洋葱表皮,结果表明,BpMYB4基因在细胞核内表达。将所构建的融合表达载体pROK Ⅱ-BpMYB4-GFP通过农杆菌介导法转入拟南芥。发现转基因植株的茎与野生型相比,生长速度加快,茎的分枝增多。木质素及纤维素含量测定结果显示,转基因株系的纤维素含量有明显的升高,木质素含量略有降低。徒手切片染色观察分析结果显示,转基因拟南芥的木质素含量降低。利用酵母单杂交技术,在随机元件文库中筛选出与BpMYB4互作的元件,即ACGTATERD1、CGACGOSAMY3、DOFCOREZM、LTRECOREATCOR15、TAAAGSTKST1。这些元件具有脱水响应,参与碳代谢,参与茎组织特异性表达,冷诱导,控制气孔生长响应等作用,推测白桦BpMYB4基因可能通过特异性识别这些元件来参与脱水响应、茎组织的碳代谢、低温诱导、气孔变化、组织特异表达等过程。将已知拟南芥细胞壁合成相关纤维素合成酶基因的启动子主要顺式作用元件与pHIS2连接,利用酵母单杂交技术,与7个拟南芥MYB转录因子进行互作分析,发现已知元件MYBST1与拟南芥AtMYB61基因互作。进一步分析结果显示,元件所在纤维素合成酶基因AtCEV1的启动子片段和拟南芥AtMYB61基因互作。表明AtMYB61可以通过MYBST1元件与AtCEV1基因互作调节纤维素合成代谢。生物信息学分析结果显示AtMYB61与BpMYB4的同源性达到61%,这两个基因在纤维素合成中的具体调控功能有待进一步研究。利用代谢组学对白桦应力木中木质部形成层相关代谢产物进行分析,发现白桦树干在弯曲处理后,有142种代谢产物发生变化,如葡萄糖1磷酸、葡萄糖醛酸、木糖醇、核糖醇、莽草酸、松柏醇等,研究发现,白桦应拉木可以通过改变木质纤维素合成过程中的代谢物,从而促进纤维素的合成,抑制木质素的合成。
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