磷酸化和去磷酸化反应是生命过程中十分重要的反应,参与生物体内许多生命活动。这两个反应与细胞内的信号级联放大系统也密切相关。细胞可以针对外界各种物理信号或者化学信号,在体内引发一系列指数级的催化磷酸化反应,进而促使核内特定基因的表达,成功完成对外界信号的应激性。当这种应激完成之后,再经过去磷酸化作用,可以去除蛋白质的活性,从而使细胞恢复到正常状态。催化这两种反应的酶主要是蛋白质激酶和磷酸酶。这两类酶的异常调控会严重影响生物的生命活动,引发许多疾病。在本论文中,我们利用电化学技术设计了两种巧妙的电化学传感体系,用于检测这两类酶催化的磷酸化与去磷酸化反应。与一些传统的检测方法相比,本论文中构建的电化学方法具有灵敏度高、选择性好、成本低及操作简便等优点,在一些疾病的医疗诊断上有一定的应用前景。1.基于滚环扩增检测蛋白质激酶催化磷酸化的电化学方法我们提出了一种基于滚环扩增的电化学方法,用来检测蛋白质激酶催化的磷酸化反应。首先,底物多肽通过其C端半胱氨酸的巯基固定在金电极表面,同时,蛋白质激酶A能够将底物多肽中的丝氨酸催化磷酸化。然后,Zr4+通过静电结合作用将该磷酸化位点与DNA引物上的磷酸基团相连,再引入模版DNA与phi29 DNA聚合酶后,滚环扩增反应就可以在金电极表面进行。由于最终得到的长链DNA产物能够吸附大量的电化学信号分子——六铵合钌,将酶的催化反应转化为电化学信号,因此蛋白质激酶A起始的催化磷酸化反应就可以通过电化学技术进行检测。该方法对于一些疾病的医疗诊断具有一定的指导意义。2.碱性磷酸酶催化去磷酸化反应的电化学检测技术我们提出了一种新型的检测碱性磷酸酶催化去磷酸化反应的电化学方法。在本研究中,我们设计了两段互补的DNA探针(DNA 1、DNA2),同时引入了λ核酸外切酶。碱性磷酸酶可以水解DNA 15’端的磷酸基团,而λ核酸外切酶能降解双链DNA中5’端含有磷酸基团的一条链。因此,当固定在金电极表面的DNA 2与被去磷酸化的DNA 1杂交后,λ核酸外切酶会将DNA 2降解。同时,当双链中的DNA 2完全降解后,DNA 1会游离到溶液中,与固定在金电极上的另外一段完整的DNA 2进行杂交,从而起始了另一个DNA 2降解和DNA 1释放的循环。由于DNA 2能够吸附电化学信号分子六铵合钌,因此当DNA 2被大量降解后,金电极表面的电化学信号分子将大大减少。据此我们建立起碱性磷酸酶与电化学信号减小量之间的关系。并且,在复杂生物样品中该方法同样得到了满意的实验结果。这种电化学方法给碱性磷酸酶催化去磷酸化反应的检测提供了一个新的思路。