论文部分内容阅读
目的:研究表明二甲双胍有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制其增殖的潜能。RIP140作为转录辅调节因子,被多次报道和代谢、炎症、肿瘤以及胰岛素抵抗相关。本文旨在初步探索RIP140在二甲双胍诱导肝癌细胞凋亡的效应中可能存在的作用机制。方法:1、计算二甲双胍IC50浓度,使用不同浓度二甲双胍(0、5.0、10.0、20.0mmol/l)干预人肝癌HepG2细胞48小时后,流式Annexin V-FITC/PI双染法、CCK-8法检测各组细胞凋亡率、增殖率,Western blot法检测各组p-AMPK、AMPK、PGC-1α、RIP140的蛋白表达水平;2、构建RIP140基因上调及下调的人肝癌HepG2细胞模型,实时荧光定量PCR法及Western blot法鉴定细胞模型,流式Annexin V-FITC/PI双染法检测该基因表达水平变化对细胞的凋亡的影响;3、下调人肝癌HepG2细胞的RIP140基因的表达水平,观察二甲双胍对其凋亡率的影响,同时Western blot法检测p-AMPK、AMPK、PGC-1α、RIP140、p53、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase 3等蛋白的表达水平。结果:1、不同浓度二甲双胍(0、5.0、10.0、20.0 mmol/l)干预人肝癌HepG2细胞48小时:1)二甲双胍干预人肝癌HepG2细胞IC50浓度为(22.08±4.50)mmol/l;2)CCK-8结果显示:二甲双胍干预48小时后可抑制人肝癌HepG2细胞的增殖,且抑制程度和剂量呈正相关(P<0.05)。3)流式结果显示:二甲双胍干预48小时后可诱导人肝癌HepG2细胞的凋亡,且诱导程度和剂量呈正相关(P<0.05)。3)Western blot结果显示:随着二甲双胍干预浓度的升高,细胞内p-AMPK/AMPK比值及PGC-1α、RIP140的蛋白表达水平均呈逐渐升高趋势,且有统计学意义(P>0.05)。2、构建RIP140基因上调及下调的人肝癌HepG2细胞模型:1)、Western Blot及实时荧光定量PCR结果显示:RIP140过表达质粒、RIP140干扰质粒构建成功,RIP140上调及下调的人肝癌HepG2细胞模型构建成功(P<0.01)。2)流式结果显示:RIP140表达上调可以增加对细胞凋亡的诱导,RIP140表达下调可以抑制对细胞的凋亡诱导(P<0.05)。3、二甲双胍对RIP140表达下调的人肝癌HepG2细胞的凋亡的影响:1)流式结果显示:RIP140干扰质粒+二甲双胍组和NC组相比,凋亡率也有明显升高,有统计学意义(P<0.05),和二甲双胍干预相比,凋亡率有所下降,无明显统计学意义(P>0.05)。2)Western Blot结果显示:和NC组相比,二甲双胍、RIP140过表达组、二甲双胍+RIP140干扰组的p-AMPK、RIP140、cleaved-caspase 3、Bax、p53蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调,p-AMPK/AMPK比值、Bax/Bcl-2比值增加,且均有统计学意义(P<0.05);和二甲双胍组相比,二甲双胍+RIP140干扰组的p-AMPK、RIP140、cleaved-caspase 3、Bax、p53蛋白表达稍下降,Bcl-2蛋白表达以及p-AMPK/AMPK比值、Bax/Bcl-2比值稍升高,但无明显统计学差异(P>0.05)。结论:1、二甲双胍可以剂量依赖性地增加PGC-1α、RIP140的表达,从而发挥抑制肝癌细胞增殖、诱导凋亡的作用,该效应可能和激活AMPK有关。2、RIP140的表达上调可以促进肝癌细胞的凋亡,表达下调可以抑制肝癌细胞的凋亡,RIP140在肝癌的发生发展过程中可能担任抑癌基因的角色。3、二甲双胍可以上调RIP140的表达,可能和激活AMPK,活化caspase 3,上调p53、Bax的表达水平及Bax/Bcl-2的比值、下调Bcl-2的表达水平有关,但是此作用机制不完全依赖AMPK的激活来调控下游凋亡相关靶基因的表达,还存在其他的旁路途径。