非甾体抗类炎药(non-steroidal anti-inflammatory durgs,NSAIDs)是现在最常用的解热消炎镇痛药,其药物品种包括对乙酰氨基酚,吲哚美辛等,双氯芬酸,阿司匹林,塞来昔布等。这些药物发生治疗作用的同时,其副作用也因药物的频繁使用日益凸显,很多情况下都是因为其副作用而停药。其中吲哚美辛引起的药物性肝损伤在临床上是其中最常见的副作用之一,本实验以正常大鼠肝细胞细胞系BRL-3A为实验对象,探求吲哚美辛对于肝损伤的作用机制,以及大蒜提取物S-烯丙基半胱氨酸(S-allylcysteine,SAC)对于此种损伤的保护作用及机制。[目 的]实验研究吲哚美辛引起的肝细胞损伤的作用及其分子机制;以及研究SAC对吲哚美辛引起的肝细胞凋亡的保护作用及其分子机制。[方 法]1.对细胞增殖能力的影响的研究:通过CCK8实验与倒置相差显微镜观察来确认吲哚美辛和SAC对肝细胞增殖能力的影响;2.对细胞凋亡的影响的研究:Tunel染色来检测吲哚美辛和SAC对肝细胞可能存在的促进或抑制凋亡能力的影响;3.Western blot实验来检测内质网应激通路上的p-eIF2 α,CHOP和Cleaved Caspase3三种蛋白表达量的变化:来确认吲哚美辛和SAC对于肝细胞的作用机制发生在内质网应激分子通路中。[结 果]1.在确认吲哚美辛对大鼠BRL-3A细胞可能存在诱导凋亡的试验中:处理方式不同浓度的吲哚美辛(12.5 μM;25 μM;50 μM;100 μM)处理24小时后,(1)CCK-8试剂盒测定结果显:吲哚美辛对BRL-3A增殖抑制的率分别为10.28%、23.63%、36.52%、61.50%差异具有统计学意义(两两对比的p<0.05),空白组和溶剂组间的细胞增殖抑制率无统计学意义(p>0.05);(2)倒置相差显微镜下观察BRL-3A形态:呈体积中等的多角形的单个核细胞,培养24小时后出现了细胞数目减少现象的细胞抑制现象,说明了吲哚美辛能引起BRL-3A细胞的抑制增殖现象。(3)TUNEL染色:细胞在TUNEL染色中能确定凋亡细胞数凋亡率为22.43%,37.54%,49.71%,72.4%(两两对比的p<0.05)差异具有统计学意义,空白组和溶剂组凋亡率之间(p>0.05)不具有统计学意义。(4)Western blot结果示:p-eIF2 α,CHOP和Cleaved Caspase 3三种蛋白随着时间增加表达水平有增加的趋势,表明吲哚美辛可能对BRL-3A细胞可能对p-eIF2 α,CHOP和Cleaved Caspase 3三种蛋白促进表达的作用,且这种促进作用呈时间依赖性(随着吲哚美辛的作用时间越长这种促进表达作用越明显)。2.在SAC的保护肝细胞凋亡的研究中:吲哚美辛组以及各组处理时间均为24小时,SAC浓度是50 μM,吲哚美辛浓度是100 μM共分为五组(空白组,溶剂组,SAC组,吲哚美辛组,SAC+吲哚美辛组)。结果显示(1)CCK-8试剂盒测定结果显:吲哚美辛组,SAC+吲哚美辛组BRL-3A增殖的抑制率分别为:67.35%、26.50%具有统计学意义(p<0.05),空白组和溶剂组间以及SAC组的细胞增殖抑制率之间差异无统计学意义(p>0.05)说明在加入SAC后能够缓解吲哚美辛对肝细胞的增殖抑制和诱导凋亡的作用。(2)倒置相差显微镜观察BRL-3A形态:在吲哚美辛诱导肝细胞凋亡的实验基础上,在加入SAC后肝细胞数目明显增加,凋亡细胞减少,贴壁生长的细胞增加,细胞形态也部分的恢复了多角形。(3)TUNEL染色:细胞在TUNEL染色中能确定各组的细胞凋亡率为63.7%,33.9%(p<0.05)差异具有统计学意义。空白组和溶剂组以及SAC组(两两对比的p>0.05)。(4)Western blot 结果示:p-eIF2 α,CHOP 和 Cleaved Caspase 3 三种蛋白在条带上显示前三组变化不明显,在吲哚美辛组开始表达量增加,在SAC+吲哚美辛组的表达含量比前三组高,但是低于单纯的吲哚美辛干预组。[结 论]1.吲哚美辛诱导了肝细胞的凋亡和抑制增殖的现象,其中p-eIF2α,CHOP和Cleaved Caspase 3三种蛋白表达量的增加的趋势解释了吲哚美辛可能是通过内质网的未折叠蛋白反应促凋亡信号通路来诱导肝细胞凋亡;2.在S-烯丙基半胱氨酸(S-allylcysteine,SAC)加入吲哚美辛诱导的细胞凋亡的实验基础上肝细胞的出现的促进增殖和诱导凋亡的现象受到了 SAC的抑制,且p-eIF2α,CHOP和Cleaved Caspase 3三种蛋白表达量减少说明了 SAC对肝细胞的作用也可能是通过内质网应激的未折叠蛋白反应来实现的,其作用是抑制吲哚美辛对于肝细胞的促凋亡作用。