【摘 要】
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丹酚酸酯酶能够特异性地水解丹酚酸B,生成丹参素和Przewalskinic acid A。本论文主要对微生物Absidia sp.D30s产丹酚酸酯酶的分离纯化和基因调取进行了研究。采用分子筛层析
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丹酚酸酯酶能够特异性地水解丹酚酸B,生成丹参素和Przewalskinic acid A。本论文主要对微生物Absidia sp.D30s产丹酚酸酯酶的分离纯化和基因调取进行了研究。采用分子筛层析法和离子交换层析法,对Absidiasp.D30s菌经诱导所产的粗酶液进行分离纯化。经三次柱法层析得到丹酚酸酯酶纯酶。经SDS-PAGE结果发现,该酶蛋白为双亚基蛋白,两个亚基的酶蛋白分子量分别为38 kDa(亚基Ⅰ)和18 kDa(亚基Ⅱ)。丹酚酸酯酶的最适反应温度为40℃;最适反应pH是5.0;K+、Na+、Ca2+、Mg2+4种金属离子对酶活力有促进作用;高浓度的Zn2+对酶活力有抑制作用;而金属离子Cu2+、Fe3+对酶反应有明显的抑制作用。将纯化的丹酚酸酯酶经过电印迹转移后,测定两个亚基的N端序列分别为GLTTQKSAPWGLGSI(亚基 Ⅰ)、VKAVAVLRGDSKISG(亚基Ⅱ)。根据丹酚酸酯酶的 N端序列设计简并引物、RT-PCR进行基因序列的调取。根据3’RACE和5’RACE技术,分别扩增出了丹酚酸酯酶两个亚基的3’端和5’端的多个基因片段并测序。最后分别将所得到的基因片段进行拼接和验证,得到丹酚酸酯酶亚基Ⅰ和亚基Ⅱ的基因全序列。亚基Ⅰ的基因全长为1829 bp,CDS区长度为1212 bp;亚基Ⅱ的基因全长为764 bp,CDS区长度为465 bp。
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