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背景与目的 肿瘤细胞多药耐药性(Multidrug resistance，MDR)是造成肿瘤化疗失败的主要原因。MDR是指肿瘤细胞对一种药物产生耐药性，同时对结构与作用机理不同的药物也产生交叉耐药性。近年来国内外研究表明谷胱甘肽硫转移酶π(Glutathione S-transferase pi,GST-π)通过对异生物质的生物转化和解毒功能参与肿瘤细胞耐药性的形成；而DNA拓扑异构酶Ⅱ(Topoisomerase Ⅱ，Topo Ⅱ)活性数量或性质上的改变引起药物诱导产生的可裂解复合物的形成减少，从而导致MDR的产生。千金藤素(Cepharanthine，CEP)是从防己科千金藤属植物的块根中提取分离出的一种双苄基异喹啉类生物碱单体化合物，具有较强的多种生物活性。最近国外研究显示其具有逆转肿瘤多药耐药的作用，其机制是否与GST-π及DNA Topo Ⅱ有关，目前尚未见报道。本实验运用细胞学和分子生物学的检测方法，观察CEP对肿瘤细胞耐药性的逆转作用，并对MDR的分子机制进行深入探讨。 方法 实验选择人乳腺上皮细胞癌MCF-7及由阿霉素(Adriamycin，ADR)诱导的具有稳定MDR表型的耐阿霉素细胞株MCF-7／ADR，采用MTT(3-(4，5-dimethylthiazol)-2，5-diphenylte-2H-tetrazoliumbromide，MTT)分析法，测定ADR单用及与CEP、维拉帕米(Verapamil，VER)合用对MCF-7、MCF-7／ADR细胞的直接细胞毒作用；采用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)法测定MCF-7、MCF-7／ADR细胞内GST-π的表达，以及药物对GST-π表达水平的影响；从MCF-7、MCF-7／ADR细胞中提取DNA Topo Ⅱ，采用考马斯亮兰G-250染色法测定酶提取液蛋白含量；采用对荆刊大学2(X)3届硕士学位论文转N℃B私虹艰细胞的多药耐药性及其与C吕手:和DNAI切扣n的关系超螺旋pBR322 DNA的解旋能力测定DNA ToPoll的活性，以及药物对Topon活性的影响。通过上述实验来阐明MCF一7/ADR对ADR产生耐药性与GST一:、DNA Topo11之间的关系及CEP逆转耐药性的机理。结果1 .ADR对MCF一7、MCF.7从DR细胞的细胞毒作用 采用MTT法测定ADR对MCF一7、MCF一7/ADR细胞的ICS。值，分别为0.50士0.03 p mol·L.‘和27.37士0.53 p mol·L.‘，二者比较差异有显著性(尸<0.05)，耐药倍数为54.7倍。2.CEP、VER对ADR细胞毒的影响 单用CEP、VER对MCF一7及MCF一7/ADR的细胞毒作用较弱，其结果为:CEPSp mol·L.‘时抑制率为(10.27士1.25)%和(9.56士2.03)%，4pmol·L’‘时为(5.10士0.52)%和(4.75士0.58)%，2 p mol·L“时为(2.34士0.71)%和(2.15士0，47)%;VER 5 p mol叱一，时抑制率为(4.96士0.39)%和(4.35士1.24)%。ADR与4pmol吃“C即合用对MCF一7细胞的ICS。值为0.49士0.02 p mof·L‘，与单用ADR比较差异无显著性(P>o.os);对MCF一7从DR细胞的ICS。值为2.03士0.09 p mol·L一‘，与单用ADR比较差异有显著性(P<0.05)，逆转倍数为13 .5倍。ADR与8 0 mof·L-lvER合用对McF一7细胞的ICS。值为0.51士0.03 p mof·L-‘，与单用ADR比较差异无显著性 (P>o.os);对MCF一7/ADR细胞的ICS。值为3.76士0.11 pmol·L“，与单用ADR比较差异有显著性护<0.05)，逆转倍数7.3倍。CEP合用组与VER合用组对MCF~刃ADR细胞的抑制作用比较差异有显著性(尸<0.05)，CEP的逆转作用强于VER。3.药物对MCF一7、MCF一7/ADR细胞GST一:表达的影响 采用IHC法检测细胞浆GST一:的表达，HIPAS一1 000高清晰度彩色病理图文分析系统进行分析，以细胞积分光密度值作为GST一二表达的量化指标。MCF一7细胞对照组积分光密度值为3.43士1.91，o.17pmol·L一IADR单用组为3.56士1.97，与4pmol·L一‘CEP合用组及与5 p mol·L一IVER合用组分别为3 .36士1.69，3.47士1.52;各组与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。MCF.7从DR对照组为49.58士7.61，9.12pmol·L一，ADR单用组为45.56士7.93，与4 p mol·L‘C即合用组及与5 p mol·L·IvER合用组分别为12.88士4.59，23.90士5.82;MCF一7/ADR细胞对照组GST一:的表达高于MCF一7细胞，二者比较差异有显著性(P<O.05)，单用ADR组与对照组比较差异无显 2郑少卜!大学2003届硕士鞠立论文反士鞠立论文千金藤素逆转N(R劝江巩细胞的多夔耐药性及其与C吕下:和DNAI切为11的关系著性(P>O.05);ADR与CEP合用组GST一:活性降低，与对照组、ADR单用组比较差异有显著性(P<O.05)，仍高于MCF一7细胞(尸<0.05);ADR与VER合用组也降低GST一:活性，与对照组、ADR单用组比较差异有显著性(P<0.05)，也高于MCF一7细胞(P丈0.05);CEP合用组降低GST一:表达的作用强于VER合用组，差异有显著性(尸<0 .05)。4.药物对McF一7、MCF一 7/ADR细胞DNA Topoll活性的影响 根据对超螺旋pBR322 DNA的解旋能力，通过Gene Genius凝胶图像分析系统对超螺旋DNA条带做半定量分析，显示单用0.17 0 mol·L一‘ADR、ADR与4 0 mol·L一‘cEP合用组、ADR与8 0 mof·L一’vER合用组对McF一7细胞DNA ToPoll活性，与加酶无药对照组比较差异无显著性(P>o.05)。McF一7/ADR?