鼻咽癌是我国南方地区最常见的恶性肿瘤之一。放射治疗一直是初治无转移鼻咽癌最主要的治疗手段。近十余年来,精确的调强放疗(intensity-modulated radiation therapy,IMRT)技术的普遍临床应用,显著地提高了鼻咽癌的局部和区域控制率,总生存率也得到了一定程度的提高。然而,治疗后仍然有部分患者出现局部复发或远处转移。局部复发或远处转移一旦发生,治疗的疗效较差,生存率极低。因此,降低鼻咽癌的复发率和转移率、提高复发和转移鼻咽癌的治疗疗效是进一步提高鼻咽癌治愈率的关键,也一直是研究的重点。本研究针对治疗失败的关键因素,拟开展:1、通过探索转铁蛋白受体TFRC影响鼻咽癌放射敏感性的作用和机制,寻找预测鼻咽癌放射敏感性的新的分子标记物和增敏放疗的新靶点,为将来筛选放疗不敏感病例,并制定相应的干预措施,降低鼻咽癌局部复发率提供基础研究的数据;2、针对远处转移鼻咽癌,在目前一线化疗方案的基础上,加用已被证实对鼻咽癌有效的抗表皮生长因子受体单克隆抗体进行治疗,观察其治疗的有效性和不良反应,为进一步研究提高远处转移患者临床疗效的综合治疗方案提供依据。该课题的研究对于最终达到提高鼻咽癌患者的治愈率有着非常重要的意义。第一部分转铁蛋白受体TFRC调节鼻咽癌放射敏感性的作用和机制目的:探索TFRC调节鼻咽癌放射治疗敏感性的作用和机制,为预测鼻咽癌放疗敏感性提出新的分子标记物和为放疗增敏提出新的治疗靶点提供基础研究数据。方法:利用公共数据库分析正常组织与头颈部鳞癌组织和鼻咽癌组织的TFRC表达的差异;采用Real-time PCR及Western blot分别检测TFRC在新鲜鼻咽癌组织和正常组织、鼻咽癌细胞株和永生化鼻咽粘膜上皮细胞株中mRNA及蛋白水平的表达差异。进一步在鼻咽癌患者的石蜡包埋标本中检测并分析TFRC的表达水平与临床预后的关系,其中生存分析采用Kaplan-Meier法,多因素分析采用Cox比例风险模型。构建TFRC过表达的CNE1和CNE2稳定细胞株,利用克隆形成实验并绘制剂量-存活曲线检测TFRC表达上调对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响;采用凋亡流式细胞术检测TFRC表达上调对电离辐射所诱导的鼻咽癌细胞凋亡的影响。接着建立裸鼠皮下成瘤放射治疗模型验证TFRC表达上调后对鼻咽癌细胞在体内放射敏感性的影响;再通过细胞内铁含量的测定、细胞内活性氧水平的测定和Western bolt检测凋亡相关蛋白的水平变化研究TFRC表达上调影响鼻咽癌细胞放射敏感性的具体分子机制;最后,在Cbioportal公共数据分析网站探索头颈部鳞癌组织中TFRC表达上调的机制。结果:TCGA头颈部鳞癌数据库显示TFRC在头颈部鳞癌组织中的表达显著高于正常组织(P<0.0001);成对组织样品中也呈现头颈部鳞癌组织中TFRC的表达显著高于正常组织(P<0.0001);鼻咽癌GSE芯片数据(GSE12452)也同样显示TFRC在鼻咽癌中的表达显著高于正常组织(P<0.0001);已发表的鼻咽癌表达谱(GSE12452)的基因集富集分析(GSEA)证明TFRC表达与鼻咽癌上调基因标签呈正相关(P<0.0001)。Real-time PCR分析显示10例鼻咽癌新鲜组织中TFRC的mRNA表达水平均显著高于3例正常鼻咽组织(P<0.0001),9株鼻咽癌细胞株(HNE1、CNE1,CNE2、SUNE1、HONE1、6-10B、5-8F、S26和S18)中TFRC的表达显著高于3株永生化鼻咽上皮细胞(N2、N5、NP69)(P<0.0001);通过免疫印迹法检测以上样品中TFRC的蛋白水平与上述结果一致。对100例鼻咽癌患者的石蜡包埋标本进行TFRC蛋白免疫组化染色并将患者分为TFRC高表达和低表达组,结果放射敏感组中TFRC高表达的患者比例明显高于放射抵抗组(P<0.001);单因素分析显示TFRC高表达组5年无局部复发生存率明显高于低表达组(89.2%vs.73.2%,P=0.041),多因素分析表明,TFRC表达水平是患者无局部复发生存的独立预测因子(P=0.017)。克隆形成实验分析显示,上调TFRC表达水平的鼻咽癌细胞接受电离辐射后,克隆团数量和大小显着减小;流式细胞术分析接受6Gy电离辐射后不同时间点(0h,24h,48h,72h)的鼻咽癌细胞凋亡情况发现,TFRC表达上调的鼻咽癌细胞的凋亡细胞比例较对照组显着增加;动物皮下瘤放射治疗模型结果显示,未接受放射治疗的注射CNE1-TFRC细胞和CNE1-Vector细胞的裸鼠皮下瘤的体积之间无显著差异(P>0.05);注射CNE1-TFRC细胞的裸鼠皮下瘤在第15天后体积不再增大反而缩小,而注射CNE1-Vector细胞的裸鼠皮下瘤在接受电离辐射后短时间内体积增长缓慢,两组裸鼠皮下瘤的体积之间具有显著差异(P<0.001)。免疫印迹实验结果显示,TFRC表达上调后,鼻咽癌细胞在接受电离辐射后细胞内线粒体途径的凋亡相关蛋白Bax、Caspase-9、Caspase-3激活更加明显,由线粒体释放到细胞浆中细胞色素C(Cyto C)水平也明显增高。上调TFRC表达后鼻咽癌细胞内铁含量均显著增高(P<0.05);鼻咽癌细胞TFRC表达上调后在接受6Gy电离辐射后细胞内活性氧(ROS)水平显著升高(P<0.001);当ROS被ROS抑制剂GSH抑制后TFRC引起的细胞内铁含量增高所促进电离辐射诱导的细胞内ROS水平的增高的作用被抵消(P<0.001)。在未接受电离辐射时,TFRC过表达细胞和Vector细胞的细胞活力无显著差异(P>0.05);然而,在接受6Gy电离辐射后,TFRC过表达细胞和Vector细胞的细胞活力均下降,且TFRC过表达细胞的细胞活力下降较Vector细胞更显著(P<0.001);当ROS被ROS抑制剂GSH抑制后TFRC上调联合电离辐射引起的细胞内ROS水平的增高所引起的细胞活力下降的作用被抵消(P<0.001)。最后通过Cbioportal分析,发现头颈部鳞癌中TFRC存在的基因拷贝数扩增,并且基因TFRC扩增与其mRNA表达上调显著相关(P<0.001)。结论:TFRC在鼻咽癌中表达显著上调,是鼻咽癌复发的独立预测因子;上调TFRC表达,在体外可以促进电离辐射抑制鼻咽癌细胞的克隆形成能力和促进电离辐射诱导的细胞凋亡,在体内可明显增强鼻咽癌细胞皮下瘤对于电离辐射的敏感性;TFRC通过将铁转运进入细胞,细胞内铁含量升高,促进电离辐射诱导的细胞内ROS水平的升高,激活线粒体凋亡途径ROS-Cyto C-Caspase-9-Caspase-3信号通路,促进细胞凋亡,增强肿瘤细胞放射敏感性;Cbioportal公共数据分析网站分析发现头颈部鳞癌TFRC表达上调可能是由于TFRC基因扩增。该研究揭示了TFRC在鼻咽癌放射敏感性中的作用,并提示该蛋白质有望成为新的潜在预测鼻咽癌放射敏感性的生物标志物和增敏放射治疗的新靶点。第二部分顺铂和5-氟脲嘧啶联合尼妥珠单抗作为一线方案治疗转移鼻咽癌的前瞻性、开放性、多中心Ⅱ期临床试验目的:观察顺铂和5-氟尿嘧啶化疗联合抗表皮生长因子受体单克隆抗体(尼妥珠单抗)作为一线方案治疗转移鼻咽癌的疗效和不良反应,为进一步进行III期临床研究提供依据。方法:本研究为前瞻性、开放性、多中心II期临床试验。主要的入组标准为接受根治性放疗后6个月发生远处转移、至少有一处可测量病灶、且未接受过任何针对远处转移治疗的患者。治疗方案如下:顺铂100mg/m2,第1天静脉注射;5-氟尿嘧啶4g/m2,第1至第4天持续微量静脉泵入,每3周为1个疗程;同时给予尼妥珠单抗200mg静脉注射,每周一次。顺铂和5-氟尿嘧啶化疗最多6个疗程;若6程顺铂和5-氟尿嘧啶方案化疗后疾病稳定则给予尼妥珠单抗200mg静脉注射、每周一次单药维持治疗,直至出现不能耐受的毒性或疾病进展。样本量的计算采用Simon二阶段设计。化疗期间每两个疗程、尼妥珠单抗维持治疗阶段和治疗结束后每3个月分别评价患者的疗效和不良反应。主要的观察指标为客观有效率(objective response rate,ORR),次要观察指标为疾病控制率(disease control rate,DCR)、无进展生存(progression free survival,PFS)、总生存(overall survival,OS)和不良反应(adverse effects,AEs)。数据分析采用SPSS 22.0软件包。本研究在clinicaltrials.gov注册,注册号为NCT01616849。结果:国内共十家医院参与本研究。2012年6月至2015年4月,共招募39例患者参加本临床试验,其中第一阶段13例,第二阶段26例;4例第二阶段入组的患者在治疗开始前退出本临床试验,故共35例患者接受了规定方案的治疗并纳入分析。在35例患者中,1例完全缓解,24例部分缓解,5例疾病稳定,3例疾病进展,2例无法评价疗效;ORR和DCR分别为71.4%(25/35)和85.7%(30/35),中位PFS和OS分别为7.0个月(95%CI,5.8-8.2)和16.3个月(95%CI,11.4-21.3)。亚组分析显示,接受≥4个疗程顺铂和5-氟尿嘧啶化疗和≥2400mg尼妥珠单抗治疗组患者的疗效优于接受<4个疗程顺铂和5-氟尿嘧啶化疗和<2400mg尼妥珠单抗治疗组的患者,两组的ORR分别为88.9%和12.5%(P<0.001),中位PFS分别为7.4个月和2.7个月(P=0.081),中位OS分别为17.0个月和8.0个月(P=0.202);此外,首程治疗结束至发生远处转移的时间间隔>12个月(HR 0.307[95%CI,0.131-0.724],P=0.004)的患者中位生存时间明显较长,但寡转移和多发转移患者之间疗效并无统计学差异。常见的不良反应包括白细胞降低(94.3%)和胃肠道反应(97.1%),3/4级不良反应主要为白细胞降低(62.9%)。结论:对接受根治性治疗后发生远处转移的鼻咽癌患者,顺铂和5-氟尿嘧啶联合尼妥珠单抗作为一线治疗方案取得了较好的疗效,尤其是接受足够剂量化疗和尼妥珠单抗的患者;该治疗方案并未增加不良反应,值得进一步开展III期临床研究。