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灰毡毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand-Mazz)作为重要的药用植物,在我国普遍种植,其有效成分绿原酸(chlorogenicacid,CGA)是植物重要的次生代谢产物,具有清热解毒、抗菌、抗病毒等重要的药用价值。而目前有关灰毡毛忍冬绿原酸合成的分子机制以及关键酶基因的研究还不够深入,因此,本论文从基因克隆、绿原酸测定、表达模式分析、原核表达、以及载体构建等方面入手,对灰毡毛忍冬绿原酸合成途径关键酶基因进行全长cDNA克隆及定量表达分析,以期为研究灰毡毛忍冬绿原酸生物合成的分子机制奠定理论基础。本论文的主要研究内容如下:(1)采用RACE方法,克隆了灰毡毛忍冬绿原酸合成途径关键酶基因Lm4CL、LmHCT及LmCCoAOMT的全长cDNA序列,结果显示Lm4CL基因全长1960 bp(GenBank:MN103349),CDS 全长 1617bp,编码 539 个氨基酸,LmHCT基因得到部分片段 840 bp,LmCCoAOMT基因全长 1096 bp(GenBank:MN103348),CDS全长735 bp,编码245个氨基酸。通过聚类分析发现,灰毡毛忍冬Lm4CL基因亲缘关系最近的是金银花,亲缘关系最远的是铁杉。LmCCoAOMT基因亲缘关系最近的是牵牛花和烟草,亲缘关系最远的是梅和枇杷。该结果表明目的基因在木本植物和草本植物之间的亲缘关系比较远,这也充分反映了木本植物与草本植物之间的差异。氨基酸序列分析表明,Lm4CL和LmCCoAOMT都为疏水性氨基酸,不具有跨膜结构,其蛋白质三级结构都以α-螺旋和β-折叠的形式存在。(2)利用RT-qPCR对这三个基因表达模式进行分析,RT-qPCR结果表明,Lm4CL基因在花中期表达量最低,在茎末期表达量最高。LmHCT基因在花早期表达量最低,在茎末期表达量最高。LmCCoAOMT基因在花中期表达量最低,在茎中期表达量最高。灰毡毛忍冬的茎、叶组织中基因表达量在生长过程中有明显增加,这也体现了这几个基因不仅是灰毡毛忍冬绿原酸合成途径关键酶基因,且可能在木质素的合成上共同发挥重要作用。(3)利用HPLC测定了花不同时期的绿原酸含量,同时比较了灰毡毛忍冬和金银花绿原酸的含量,结果表明,灰毡毛忍冬花早期绿原酸含量为2.88%,中期为2.56%,末期为2.81%。金银花花早期绿原酸含量为2.59%,中期为2.22%,末期为1.37%,灰毡毛忍冬不同时期绿原酸含量都高于金银花绿原酸的含量。利用矩阵分析了基因表达量和绿原酸含量的相关性,结果表明,Lm4CL基因表达量与绿原酸含量显著正相关,Lj4CL基因的表达量与绿原酸的含量呈现极弱的负相关性。LmHCT基因的表达量与绿原酸的含量呈显著负相关性,LjHCT基因的表达量与绿原酸的含量呈较强正相关性。LmCCoAOMT基因的表达量与花期绿原酸的含量呈较弱正相关性,LjCCoAOMT基因的表达量与绿原酸的含量呈较强正相关性。(4)构建 了 Lm4CL-pCold-TF、LmCCoAOMT-pCold-TF原核表达载体,在体外表达蛋白,分析了 0.0、0.4、0.6、0.8mmol/L不同浓度的IPTG对蛋白表达的影响。结果表明,两种蛋白主要以包涵体的形式存在,Lm4CL蛋白与pCold-TF空载相比,100 kD-150 kD处有大量的蛋白富集,在0.6 mmoI/L浓度下的IPTG诱导效果最好。LmCCoAOMT蛋白与pCold-TF空载相比,在大约70kD-100kD处有大量的蛋白富集,在0.8 mmol/L浓度下的IPTG诱导效果最好。除此之外对以上蛋白进行了纯化,获得了良好的纯化效果。(5)构建了 Lm4CL-pCAMBIA 1301、LmCCoAOMT-pCAMBIA1301 真核表达载体,为探究绿原酸合成分子机制、进一步提高绿原酸含量奠定理论基础。