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甜叶菊为天然低热量高甜度的新型甜味剂的来源植物,其叶片中的甜菊糖苷甜度约为蔗糖的200-300倍,其中RA（rebaudioside A）、RD（rebaudioside D）和RM（rebaudioside M）为优质糖苷;甜叶菊还具有降血压,抑菌,抗结核等药理作用。选育耐盐和高优质糖苷含量的甜叶菊品种将有助于甜叶菊种植业发展。离体培养条件下,通过辐射诱变等技术创制突变体是植物获得优良品种的重要途径之一。本试验在课题组前期研究的基础上,开展了耐盐、硼和喜锌的优质甜叶菊突变体创制和筛选工作,并初步建立了高RA苷甜叶菊突变体的烘干工艺,同时基于转录组测序对耐硼和喜锌的高RA糖苷突变体的变异机制进行了初步探讨。为甜叶菊的优良品种选育和加工奠定了物质基础,提供了一定理论和技术支撑。主要研究结果如下:1.经过筛选,激素配比为6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L的T1培养基上甜叶菊叶片愈伤组织诱导率达100%,明显高于其他外植体诱导培养基;激素配比为6-BA2.0+IAA0.5的Y6培养基相对其他培养基上愈伤组织生长状态最好,无明显褐化,为最佳愈伤组织诱导成芽培养基。采用愈伤组织辐射诱变的方式,利用高盐、硼和锌培养基进行筛选,共得到7个耐盐突变体植株,其中1-3号为耐Na Cl植株,4-7号为耐Na2SO4植株,未得到耐Na HCO3突变体植株;此外在高浓度硼培养基上筛选得到突变体植株GP,高浓度锌培养基上筛选得到突变体植株GX。2.利用组培扩繁技术得到上述各耐盐突变体株系。测定各突变体株系叶片糖苷含量,考察其各自主要农艺性状。结果发现选育出的7个耐盐突变体株系的农艺性状和糖苷含量均出现了不同程度的变异。其中株高变化幅度为35.00-66.33cm,以3号株系最高,比对照增高28.37%。茎粗变化幅度为2.31-5.48cm,以3号株系茎最粗,比对照增粗22.67%。此外,节间长变化范围为19.00-36.00cm,6号株系节间长最短,较对照缩短了45.17%。叶长、叶宽的变化幅度分别为50.62-63.73cm和8.89-12.16mm。主要产量农艺性状茎鲜重和叶鲜重变化范围分别为1.80-24.34g和2.80-26.06g,以3号茎鲜重和叶鲜重增重最多,分别较对照增重175.65%和67.06%。而茎折干率并无明显变化,叶折干率除6号提高了37.41%外,其余耐盐突变体株系并无明显变化。同时,RA、RD和RM糖苷变化范围分别为5.00-6.95%,1.21-3.03%和0.64-0.87%。与未经诱变的对照植株相比,7号突变体株系RA苷提高45.63%;3号RD苷提高32.03%,并且3号株系在叶鲜重、茎鲜重、株高和茎粗等主要农艺性状均显著高于对照,为综合性状良好的耐盐突变体。3.GX和GP突变体株系的RA苷含量分别达到10.93%和10.56%,比对照提高近2倍,其单株叶干重产量分别达到了41.42g和44.17g,为对照单株产量的2.5倍以上,且GX和GP突变体的其他主要农艺性状如茎粗、叶长和叶宽等主要农艺性状值均明显高于对照,二者为高产优质的高RA型甜叶菊新品系。此外,GP突变体株系硼含量为25.77mg/kg,与对照间无显著差异;GX突变体株系的锌含量为41.94mg/kg,显著高于对照。4.分别采用45℃、60℃、80℃和100℃温度梯度,按杀青和未杀青两组,以及阴干处理对大田种植采收的蕾期GP株系叶片进行干燥,利用高效液相色谱HPLC测定其糖苷含量。结果发现,阴干处理达到恒重的时间为48小时,明显长于其他烘干处理至恒重时间。但在阴干条件下GP叶片RA苷含量为11.37%,为所有处理中含量最高。其次为45℃恒温烘干,RA苷含量为10.53%。建议采收后直接薄摊阴干或晒干,如大面积种植或遇阴雨季节或天气,宜采用45℃烘干。此外,RD苷含量以100℃恒温处理者最高,且明显高于其他干燥处理RD苷含量,认为RD苷类型甜叶菊叶片干燥应以100℃恒温处理为宜。5.取GP和其原始来源植株023叶片分别进行转录组测序,筛选与硼转运有关的差异性表达以及在GP中特异性表达的转录因子,结果在GP突变体中筛选出1个与硼向胞外转运相关的SrNIP家族候选转录因子,其表达量比对照增加3.324倍;并筛选出5个在GP突变体中特异性表达的转录因子,其中SrGGCT家族1个,P450家族1个,SrPKC家族2个,SrPAP家族1个。本试验还筛选出8个在GP和023中有明显差异的UDP-葡萄糖基转移酶基因,其表达量最高比对照023上调8.4224倍,而直接参与催化ST苷形成RA苷的糖基转移酶SrUGT76G1的基因表达量为对照植株的1.575倍;此外,还对除糖基转移酶基因外的其他甜菊糖苷生物合成途径关键酶基因进行比较,结果发现有1个SrKAH基因表达量为对照植株1.403倍;SrCDPS1、SrKS和SrDXS2基因表达量则分别为对照植株2.379、5.032和2.127倍。6.以原始来源植株023为对照,对GX突变体进行叶片转录组测序。结果发现,GX突变体中有2个SrZIP家族负责锌向胞内转运的候选转录因子,表达量分别为对照植株1.377和1.307倍;还筛选出12个在GX突变体中特异性表达的转录因子,其中AP2/ERF家族3个,cullin家族1个,P450家族1个,SrPKC家族2个,SrSAMS家族1个,Glyco 32家族2个,SrDIR家族1个,SrGlu R家族1个。本试验还筛选出8个UDP-葡萄糖基转移酶基因,表达量均较对照植株有所增加,最高为对照植株表达量16.855倍,其中直接催化ST苷形成RA苷的糖基转移酶SrUGT76G1的基因表达量为对照植株1.908倍。至于糖基转移酶基因外的其他甜菊糖苷生物合成途径关键酶基因,发现其中1个SrKAH基因表达量为对照植株4.270倍,而SrCDPS1、SrDXS2和SrGGPPS2基因表达量分别为原始植株13.821、4.270和3.134倍。此外,筛选出2个表达量差异显著且参与其他萜类物质合成的基因SrCDPS2,其中一个表达量为对照植株25.191倍,另一个在GX突变体中特异性表达。综上,与对照原始植株相比,GP突变体中与硼转运有关的1个转录因子和GX突变体中与锌转运有关的2个转录因子,及其各自甜菊糖苷生物合成途径中的部分关键酶基因和糖基转移酶基因SrUGT76G1表达量均出现明显变化,这应与它们的耐硼、喜锌特性以及高RA糖苷含量密切相关。此外,还在GP和GX突变体中发现一些特异性转录因子,推测与GP和GX突变体的农艺性状、抗逆性以及其他次生代谢产物含量变化密切相关,但这些候选转录因子在GP和GX突变体中的具体作用,尚有待进一步试验加以验证。