肾肉瘤样癌细胞系的建立和肾癌噬菌体展示肽库的构建

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目的:建立汉族人肾肉瘤样癌细胞系,研究该细胞系的生物学特性,筛选肾肉瘤样癌高转移性细胞亚型;构建肾癌噬菌体展示肽库和肾透明细胞癌特异性噬菌体展示肽库,进行肾细胞癌早期检测分子标志物的筛选。方法:(1)采用1例肾肉瘤样癌新鲜手术标本,于手术后30-60min内用植块法进行体外培养,确定肿瘤病理学特点和染色体众数,记录细胞系的生长曲线,集落形成率,应用流式细胞仪检测细胞的肿瘤干细胞表面标志物。(2)构建肾癌噬菌体展示肽库:收集肾癌组织标本30例和肾癌细胞系3种48瓶。利用Trizol试剂抽提总RNA,用纯化试剂盒抽提mRNA,再经过反转录、末端平齐化、加EcoRⅠ/HindⅢ接头、HindⅢ和EcoRⅠ双酶切、大小片段筛选、连接载体臂、噬菌体体外包装等一系列反应,成功构建了肾癌噬菌体展示肽库。(3)肾癌特异性的噬菌体的富集:用正常对照和肾癌患者的血清进行五轮正负向亲和筛选,以富集可以和肾癌患者血清中自身抗体相结合的特异性噬菌体单克隆。(4)肾癌特异性噬菌体的筛选:五轮正负向筛选后,随机挑选了的2000个噬菌体单克隆,用ELISA法进行初筛。结果:(1)肿瘤组织样本免疫组化结果显示:Vimentin、CD10、CAM、Ki67呈强阳性,肾肉瘤样癌细胞系可长期生长和稳定传代,经历12个月传120代。倍增时间为18小时。细胞形态不规则、线粒体发育不全,胞浆内糖原聚集;细胞普遍存在超二倍体现象,染色体数目和结构异常明显;肿瘤干细胞标志物CD24,CD99,CAM,E-cadherin表达阳性;细胞具有一定的运动侵袭能力,混合细胞系成瘤率100%,细胞亚克隆无致瘤能力。(2)由肾癌组织建立的噬菌体展示肽库滴度为2.52×105pfu/ml,重组率为95.83%,500bp以上的插入片段占65.2%。由肾癌细胞系建立的噬菌体展示肽库滴度为1×105pfu/ml,重组率为33.33%,最大插入片段1200bp。经亲和筛选和扩增的肾透明细胞癌特异性噬菌体展示肽库滴度为5.6×1010pfu/ml。结论:(1)利用汉族人肾肉瘤样癌组织成功建立了细胞系,该细胞系具有肿瘤干细胞特征性表面标志。(2)建立的肾癌噬菌体肽库和肾透明细胞癌特异性噬菌体肽库的滴度和丰度较好,噬菌体表面插入片段大小不同,预示着所编码的多肽或者蛋白的多样性较好,可用来进行后续的实验,筛选肿瘤特异的血清学指标及其它研究。
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