塞内卡病毒A（Senecavirus A,SVA）是属于小RNA病毒科的单股正链RNA病毒,该病毒于2002年首次发现,并被归类为新的病毒属——塞内卡病毒属。自然感染SVA的母猪发病表现为厌食、短暂的低烧、蹄部及口鼻处有充满水泡液或破裂的水疱,并且SVA病毒感染也可能导致新生仔猪死亡。脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus,EMCV）也是小RNA病毒科的单股正链RNA病毒,是一种重要的人畜共患病病毒,引起以仔猪脑炎、心肌炎或心肌周围炎症和母猪繁殖障碍为主要临床特征的急性传染病,还可以引起亚临床感染,对世界养猪业造成了较严重经济损失。SVA和EMCV的基因组十分相似,并且这两种病毒不排除在临床中混合感染的可能性。本研究选择SVA和EMCV的保守区域3D基因设计合成引物,建立了可以同时检测SVA和EMCV的双重荧光定量PCR和双重RT-PCR方法,这两种方法均可用于猪群SVA和EMCV感染监测和流行病学初步调查。本研究具体内容如下:1.塞内卡病毒A和脑心肌炎病毒双重PCR检测方法的建立本研究以SVA和EMCV的3D基因序列为靶基因设计并合成了引物和探针,通过优化反应条件,建立了可以同时检测这两种病毒的双重荧光定量PCR和双重RT-PCR方法。特异性试验结果表明,这两种检测方法均可以诊断SVA与EMCV,并对其他病毒无扩增,具有良好的特异性;敏感性试验结果显示,双重RT-PCR方法检测SVA和EMCV的最小浓度分别为1.0×105 copies/μL和7.6×104copies/μL,双重荧光定量PCR方法检测SVA和EMCV的最小浓度分别为 7.6×102copies、μL和9.8 ×101copies/μL,是双重RT-PCR方法的1000倍;通过双重荧光定量PCR方法建立的标准曲线也具有良好的线性关系;在重复性试验中,双重荧光定量PCR方法的变异系数小于5%,用双重RT-PCR方法对高、中、低三个浓度的模板进行了三次重复检测,结果稳定且一致。上述结果表明,本研究建立的两种检测方法均可准确快速同时诊断SVA和EMCV,并具有良好的特异性、敏感性和可重复性。比较两种检测方法,双重荧光定量PCR方法更为灵敏。2.两种PCR方法的临床应用分别用两种PCR检测方法对采集于各地猪场的132份病料样品进行检测。结果显示,双重荧光定量PCR检测出69份阳性,阳性率为52.27%,其中SVA阳性病料67份,阳性率为50.76%;EMCV阳性病料26份,阳性率为19.70%;混合阳性感染病料23份,混合感染率为33.33%。双重RT-PCR共检测出67份阳性,阳性率为50.76%,其中SVA 阳性病料62份,阳性率为46.97%;EMCV阳性病料17份,阳性率为12.88%;混合阳性感染病料12份,混合感染率为17.91%。上述结果显示,建立的两种PCR方法均可用于临床检测,双重荧光定量PCR方法比双重RT-PCR方法具有更高的灵敏度,能够更有效地检测SVA与EMCV,具有良好的应用前景。临床样品阳性率结果表明,我国猪群普遍存在SVA和EMCV感染,且两种病毒的混合感染率较高。