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猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）是一种自主复制型单股负链DNA病毒,其复制完全依赖于宿主细胞的复制酶系统。PPV基因组主要包含两个开放性阅读框（Open reading frame,ORFs）ORF1和ORF2,ORF1编码非结构蛋白NS1、NS2和NS3,ORF2编码结构蛋白VP1和VP2。其中,VP2是病毒最重要的结构蛋白,占病毒衣壳组分的90%以上,是PPV最主要的免疫原性蛋白,能够刺激机体产生免疫反应,并且在病毒复制过程中发挥重要作用。微小染色体维持蛋白3（Minichromosome maintenance protein 3,MCM3）是MCM2～7复合物的组成亚基之一,参与了调控MCM复合物的组装,并与细胞DNA复制起始位点结合,从而影响细胞DNA的复制。还有研究报道,MCM复合物参与调控腺联病毒、疱疹病毒以及人细小病毒等多种病毒的复制过程。本实验室前期研究发现,在PPV感染过程中,PPV VP2通过与MCM3互作招募MCM3至病毒复制起始位点,促进病毒的复制。然而,PPV VP2是如何劫持MCM3促进自身复制的机制迄今尚不清楚。本研究拟首先制备VP2和NS1的多克隆抗体。然后,通过real-time PCR检测PPV感染PK-15细胞后病毒和细胞DNA的复制水平,通过Co-IP和Ch IP试验检测PPV感染PK-15细胞后MCM3与组蛋白H3的结合能力以及MCM3与细胞DNA复制起始位点的结合能力,研究PPV感染对宿主细胞DNA和自身复制的影响。最后,检测PPV感染对PK-15细胞MCM3表达及磷酸化水平的影响,确定MCM3磷酸化位点及调控MCM3磷酸化的关键病毒蛋白;检测MCM3磷酸化对VP2与MCM3的互作、MCM3与组蛋白H3的互作以及对PPV复制的影响。研究结果旨在阐明PPV VP2劫持MCM3促进自身复制的机制,为进一步探索PPV的致病机制提供理论依据。研究取得如下结果。1.扩增并纯化得到PPV病毒粒子。构建NS1特异性片段（1395 nt～1986 nt）ns1s的原核表达载体p ET-32a-ns1s,经表达纯化得到NS1S重组蛋白。分别用纯化的PPV病毒粒子和NS1S重组蛋白免疫BALB/c小鼠,成功制备出鼠抗PPV VP2和NS1的多克隆抗体,间接ELISA和western blotting检测结果显示,鼠抗PPV VP2和NS1多克隆抗体效价均为1:256000,并且能够很好的识别原核/真核表达的PPV VP2、NS1重组蛋白以及PPV感染PK-15细胞内源性PPV VP2和NS1。2.以1 MOI PPV感染PK-15细胞,在感染0、12、24 h后real-time PCR检测PPV和细胞DNA复制水平的变化,结果显示,随着感染时间的延长,PPV病毒拷贝数显著升高（P<0.05）,宿主细胞DNA拷贝数显著降低（P<0.05）。Co-IP和Ch IP检测PPV感染后MCM3与组蛋白H3的结合情况以及MCM3与细胞DNA复制起始位点Lamin b2prom以及dhfr prom的结合情况,Co-IP结果显示,与Mock对照组相比,PPV感染组MCM3与组蛋白H3的结合能力显著降低（P<0.05）;Ch IP结果显示,与Mock对照组相比,PPV感染组MCM3和细胞DNA复制起始位点Lamin b2 prom以及dhfr prom的结合能力显著降低（P<0.05）。3.以1 MOI PPV感染PK-15细胞,在感染0、12、24、36 h后western blotting检测MCM3的表达及磷酸化水平的变化,结果显示,随着PPV感染时间的延长,MCM3总蛋白的表达无明显变化（p>0.05）,MCM3 160位苏氨酸的磷酸化水平显著降低（P<0.05）。重组质粒pCI-Flag-ns1、pCI-His-vp2分别转染PK-15细胞,在转染0、12、24、36 h后western blotting检测MCM3的表达及磷酸化水平的变化,结果显示,随着转染时间的延长,NS1重组质粒转染组中MCM3 160位苏氨酸的磷酸化水平显著降低（P<0.05）;而VP2重组质粒转染组中MCM3 160位苏氨酸的磷酸化水平无明显变化（P>0.05）。用重组质粒pCI-His-vp2与pCI-neo或与pCI-Flag-ns1共转染PK-15细胞,Co-IP结果显示,与pCI-His-vp2和pCI-neo共转染组相比,pCI-Flag-ns1和pCI-His-vp2共转染组中VP2与MCM3结合能力显著增加（P<0.05）。用重组质粒pCI-Flag-ns1转染PK-15细胞,Co-IP结果显示,与pCI-neo空载体转染组相比,pCI-Flag-ns1转染组中MCM3与组蛋白H3的结合能力显著降低（P<0.05）。最后构建过表达Flag-MCM3T 160A重组蛋白的PK-15细胞,1 MOI PPV感染野生型PK-15细胞、PK-15MCM3细胞和PK-15MCM3T160A细胞,在感染后24 h检测病毒粒子拷贝数、TCID50以及PPV VP2的表达,结果显示,与野生型PK-15细胞感染组相比,PK-15MCM3细胞感染组和PK-15MCM3T160A细胞感染组病毒粒子拷贝数和TCID50均显著升高（P<0.05）,同时,PPV VP2的表达也显著升高（P<0.05）;与PK-15MCM3细胞感染组相比,PK-15MCM3T160A细胞感染组病毒粒子拷贝数和TCID50均显著升高（P<0.05）,同时,PPV VP2的表达也显著升高（P<0.05）。本研究成功制备出鼠抗PPV VP2和NS1的多克隆抗体。发现PPV感染PK-15细胞后随着感染时间的延长,PPV复制水平显著升高,而细胞DNA复制水平却显著降低,MCM3与组蛋白H3及细胞DNA复制起始位点的结合能力显著降低。发现PPV NS1是PPV感染抑制MCM3 160位苏氨酸磷酸化的关键病毒蛋白,并且MCM3磷酸化降低促进了VP2与MCM3的互作、抑制了MCM3与组蛋白H3的互作。构建了MCM3T160A过表达细胞系,并命名为PK-15MCM3T160A细胞,发现了MCM3 160位苏氨酸磷酸化位点的突变显著促进了PPV的复制。上述研究结果阐明了PPV VP2劫持MCM3促进自身复制的分子机制,为进一步探索PPV的致病机制提供理论依据。