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L-苹果酸是一种重要的天然有机酸，TCA循环中的重要一员，广泛应用于食品、医药及化工等领域，市场前景巨大。微生物发酵法生产L-苹果酸具有许多优点和良好的应用前景，成为近年来的研究热点。使用野生菌株发酵生产L-苹果酸往往伴有大量副产物，而通过基因工程手段构建的L-苹果酸生产菌可消除副产物的影响，引导代谢流更多地流向目标产物。大肠杆菌因遗传背景清楚，并且经改造已成功生产如乳酸、琥珀酸等产品，开始被国内外学者关注，用于构建L-苹果酸生产菌。本文基于产琥珀酸重组大肠杆菌Escherichia coli B0013-1050的琥珀酸合成途径，利用Red同源重组系统和Xer/dif重组酶系统对其进行改造，构建L-苹果酸的合成途径。首先阻断L-苹果酸的下游支路，敲除了富马酸酶基因(fumB、fumC)和苹果酸酶基因(maeB)，所得到的重组菌株E. coli2030在厌氧条件下可转化葡萄糖生成L-苹果酸，主要副产物为丙酮酸和琥珀酸。在15升发酵罐中进行发酵实验，通过在转厌氧发酵时添加碳酸氢钠来补充CO2，引导代谢流去往L-苹果酸合成途径，降低丙酮酸的转化率。厌氧发酵30h，最终产L-苹果酸12.5g/L，葡萄糖-苹果酸转化率为52.1%，生产强度0.42g/(L·h)。为加强L-苹果酸合成途径，本文克隆了黄曲霉的苹果酸脱氢酶基因并在重组菌内表达，引导代谢流更多的流向所构建的合成途径。将黄曲霉苹果酸脱氢酶基因与高、中、低三种不同拷贝数质粒连接，导入重组菌，考察苹果酸脱氢酶表达量对重组菌产L-苹果酸的影响。研究发现为了获得较好的强化效果，需要将苹果酸脱氢酶表达量控制在较低水平。为了实现苹果酸脱氢酶的稳定遗传并控制其表达量在较低水平，将黄曲霉苹果酸脱氢酶基因整合表达于重组菌E. coli2030，构建重组菌E. coli2040。通过摇瓶发酵试验，发现对比于游离表达，整合表达获得了更高的L-苹果酸转化率。对该菌株进行15升罐发酵试验，厌氧发酵30h，产L-苹果酸14g/L，转化率60.3%，生产强度0.47g/(L·h)。是本文所构建重组菌中L-苹果酸转化率最高的一株，但与国外文献报道的产量与转化率相比还存在一定的差距，需要后期继续研究，进一步提高重组菌的产酸能力。