论文部分内容阅读
霉酚酸(Mycophenolic acid，MPA)是次黄嘌吟单核苷酸脱氢酶(IMPDH)的抑制剂，研究相继发现其有免疫抑制、抗肿瘤、抗病毒及抗炎等多种效应。霉酚酸酯(MMF，商品名骁悉)是它的酯类前体，目前主要作为一种新型的免疫抑制剂使用，在实体脏器移植中抗排异和骨髓移植中防治移植物抗宿主病具有良好的临床疗效。 MPA的主要作用机理是抑制次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶(IMPDH)，该酶是鸟嘌呤核苷酸从头合成途径的限速酶。IMPDH受抑导致鸟嘌呤核苷酸生成减少，进而DNA、RNA合成受阻。T、B淋巴细胞比其他类型细胞更多地依赖从头合成途径。而且，MPA对Ⅱ型IMPDH酶(表达于活化的淋巴细胞)的抑制能力，比对Ⅰ型IMPDH酶(在大多数细胞表达)的抑制能力强5倍。因此，相对于其它细胞而言，MPA具有更强的抑制淋巴细胞增殖的能力。 关于MPA作用机理的研究，最新进展发现其有诱导细胞凋亡的作用，且可能对淋巴细胞和单核巨噬细胞有选择性。进一步阐明MPA对细胞凋亡的诱导作用，是进一步阐明MPA的作用机理及扩大MPA应用适应症的有效途径。国外有少数报道认为MPA可诱导活化T淋巴细胞凋亡，但也有不同的观点。另有学者报告MPA可诱导IL-3依赖的小鼠造血细胞系发生凋亡，在IL-3存在的情况下，MPA作用小鼠32D髓细胞，FL5.12及BaF 3前B细胞，均诱导凋亡，提示MPA在治疗血液系 浙江大学硕士学位论文统恶性疾病的潜在价值。本研究选择人急性T淋巴细胞白血病细胞株M＊一为研究对象，以B淋巴细胞系的人Burkitt淋巴瘤细胞株Ran作为细胞对照，免疫抑制剂 CsA作为药物对照，采用形态学、DNA梯形条带检测、Annexin V－PI双标记法和细胞周期分析等方法，研究 MPA对 M。It－4细胞调亡的影响作用。国内尚无相关研究报道。 本研究首先采用瑞氏一姬姆萨染色，光学显微镜观察形态学：结果显示，10P mol／L MPA处理 72 ，J’时后，Molt－4细胞出现凋亡细胞的形态学特征，表现为胞浆空泡化，细胞体积缩小，核染色质国缩，核边聚，染色质断裂，出芽，凋亡小体形成等：进一步透射电镜观察，证实上述凋亡特征性改变存在；＊j细胞未见明显凋亡形态学改变。in moMi CsA处理 Molt－4细胞 72小时后也未见凋亡形态学改变。 DNA梯形条带检测：in mol／L和 10 u moWMPA作用 Molt－4细胞 48小时后，以盐析法提取细胞DNA，琼脂糖凝胶电泳，出现凋亡特征性的DNA梯形条带（DNA Ladder）； 0．in MPA处理后未见明显梯形条带，可能是由于凋亡率较低，方法不够敏感所致；0．lpmol／L～10opol儿 MPA处理＊ 细胞 48 d＼时后未见梯形条带。0．in moto和 in moMi CsA处理 Molt4细胞 48小时，亦未见 DNA梯形条带。 nnexin V－PI双标记法流式细胞仪分析：不同浓度（0，0．1，1，10pmol／L）MPA处理M。It－4细胞，Annexin V阳性细胞百分率不同（F＝209．204，P（．001）：Molt－4细胞经eA作用不同时间（0，24h，48h），Annexin V阳性细胞百分率亦不同（F＝24．933，P＜0．001）。0．1卜mol／L MPA作用 MOlt－4细胞24h，与空白对照比较，Annexin V阳性细胞百分率即有显著差异（P＝0．028）。经双因素相关分析，MPA作用于Molt个细胞，诱导Annexin V阳性细胞百分率呈药物浓度依赖O司．807，P＜0．001）手作用时间依赖性（r＝0．467，P二0．014）。表明0．l叩ol／L～10opol 卜浓度的MPA诱导M＊ 细胞凋亡，并呈时间及浓度依赖性。不同浓度①，0．l，＊10叩ol／L）nA处理对照组Ran 细胞48h，Annexin V阳性细胞分别为0．92％土0．28％，1．04％土 0．49％，1．36％士 0．93％和 1．9％10．3％，无显著性差异（F二1．79， 2 浙江大学硕士学位论文P＝0．227），表明此浓度范围的MPA不诱导Ran细胞调亡。不同浓度（0，0．1，lopol／L）对照组药物CsA处理Molt－4细胞48h，Annexin y阳性细胞分别为 14．42％土1．46％，15．08％土1．of％，16．52％士1．86％，无显著性差异（F＝l．576，P＝0．282），表明此浓度范围的CSA不诱导饲。It－4细胞凋亡。 通过流式细胞仪检测细胞DNA含量分布分析细胞各周期的变化：不同浓度 ①，1，10Pmol／L）yA处理Molt4细胞72 ’J’时后，亚GI期细胞百分率增加里药物浓度依赖性（r＝0．888 P＝0．001）。Molt－4细胞经周叩of／L MPA作用 72小时后，与空白对照组相比，S期细胞明显增多（P＝0．035），GZ周期细胞明显下降（P＝0．020）。采用双因素相关分析发现S期增加与亚m 期增加相关（r＝0．786，P＝0．012），MPA可能通过阻滞M。It－4细胞于细胞周期的S期，最终导致MOlt－4细胞凋亡。 综上所述，我们认为①0．lopol／L～10opol／L的MPA诱导M＊ 细胞凋亡，并与时间及浓度呈依赖相关性。②0．l叩of几～10叩ol几 MPA不诱导购i细胞凋亡。③0．l叩ol～l卜mol／L的CsA不诱导Molt＊细胞凋亡。创卜mol／L～10pmol／LMPA作用Moft4细