目的:液体富硒深层发酵,操作安全、短时间内可以获得高生物量的富硒活性物质。通过研究灵芝液体富硒深层发酵,探究其菌丝生理生化指标、含硒活性物质活性和硒与大分子的结合方式,了解灵芝集硒特性,为硒资源的利用拓展途径,为科学补硒、发展硒经济、硒产业,奠定基础。方法:以菌丝体生物量为考察指标,对硒酸钠、亚硒酸钠、硒代蛋氨酸这三种硒源进行筛选,并在此基础上对发酵工艺进行响应面优化。利用试剂盒法测定灵芝菌丝T-SOD、POD、PPO活性和MDA、PRO含量。通过超声辅助碱提、水提的方法提取多糖,Sevage法初步纯化,硫酸蒽酮法测定多糖含量。采用磷酸缓冲液作为溶剂、硫酸铵进行沉淀、透析的方法得到粗提的可溶性蛋白,考马斯亮蓝G250法测定蛋白含量。分析比较活性物质抗氧化活性。采用微波消解、原子荧光光谱法测定总硒、活性物质的硒含量。采用连续提取法依次提取水溶性、盐溶性、醇溶性、碱溶型蛋白并测定其硒含量;氨基酸自动分析仪研究菌丝中水解氨基酸种类、含量,采用LC-MS定性定量分析菌丝硒代氨基酸含量。CCK-8法测定富硒灵芝硒多糖、硒蛋白对HCCLM、A549、HSC-3这三种不同肿瘤细胞的抑制效果,同时未加硒组作对照。结果:1、富硒灵芝液体发酵的最佳硒源为亚硒酸钠,响应面优化发酵工艺结果为硒浓度95μg/m L、发酵温度30℃,发酵周期11 d,初始发酵液pH自然,生物量为5.6597 g/L,菌丝转化亚硒酸钠为有机硒的硒源利用率为4.7942%;2、加硒组POD、T-SOD活性、PRO含量低于对照组,PPO活性、MDA含量高于对照组,在此硒浓度下,促进了PPO活性,但POD、T-SOD活性受到抑制,菌丝抗逆性下降;3、超声辅助碱提取多糖含量较高,更能促进多糖的析出,加硒组硒多糖、硒蛋白含量均高于对照组;4、在硒多糖、硒蛋白质量浓度为5 mg/m L时,对DPPH自由基的清除率达到最大,且加硒组高于未加硒组;在硒多糖、硒蛋白质量浓度为2 mg/m L时,对铁还原力、ABTS自由基清除率达到最大,且加硒组高于对照组。硒蛋白对DPPH自由基、还原力、ABTS自由基均有较强的抗氧化作用,碱提多糖对DPPH自由基的清除力优于水提多糖;5、相较对照组,加硒组硒多糖、硒蛋白的硒含量较高,表明无机硒的添加有利于硒多糖、硒蛋白的积累;碱提硒多糖的硒含量较水提硒多糖高,表明碱法提取更有利于多糖硒的积累。对比加硒组和未加硒组菌丝中不同溶解性蛋白发现,水溶性蛋白中的硒含量最高,分别为419.2916、11.4083μg/g;6、灵芝菌丝水解氨基酸种类有17种,其中天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸含量较高,胱氨酸、蛋氨酸含量较低;硒代甲硫氨酸和硒代胱氨酸是富硒灵芝菌丝中有机氨基酸存在的主要形式;7、加硒组硒多糖对HCCLM、A549、HSC-3肿瘤细胞的抑制增殖效果要优于对照组,其对HCCLM、A549、HSC-3肿瘤细胞的IC50分别为3.765、3.23、2.267 mg/mL;加硒组硒蛋白对HCCLM、A549、HSC-3肿瘤细胞的IC50分别为636.987、506.97、555.598μg/mL,抑制增殖效果较对照组差,可能是硒蛋白中硒含量较高抑制了蛋白的活性。结论:灵芝菌丝有较强的耐硒能力,以液体富硒深层发酵方式集硒具有良好的效果,菌丝中硒与大分子的结合方式有硒多糖、硒蛋白、硒代胱氨酸、硒代甲硫氨酸,不仅为富硒灵芝在生物、分子水平的深层次研究提供一定参考,而且为硒资源的利用提供理论和技术支撑。