目的:　　 构建含frataxin基因的原核表达载体,分离纯化有活性的frataxin蛋白和hIscA,探索氧化压力对frataxin与铁作用效果的影响,为进一步研究体内frataxin转运铁的机制奠定基础。　　 方法:　　 1.含frataxin基因的原核表达载体的构建采用PCR方法,以pET26b(+)-FXN为模板,扩增FXN基因,并将其克隆入原核表达载体pET28b(+),测序鉴定质粒构建是否正确,将其转入E.Coli BL21中,IPTG诱导其表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物。　　 2.表达上清中frataxin与hIscA的纯化与apo-FXN与ado-hIsea的制备表达的N端带His标签的frataxin和hIscA蛋白,通过镍柱亲和层析的方法纯化,SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析表达产物,对hIseA特征峰扫描。纯化后的frataxin与hIscA蛋白溶液中加入10mM的EDTA在37℃孵育30分钟。再经过脱盐柱纯化,得到脱铁后的蛋白,脱铁效果用菲咯嗪分光光度法鉴定和全波长扫描。　　 3.Frataxin活性的检测　　 (1)测定frataxin的铁结合活性,首先将纯化的apo-FXN,DTT与不同浓度的Fe2+和柠檬酸混合,以加和不加H2O2作为对比,在37℃孵育30分钟。然后用G-25脱盐柱重新纯化反应后的frataxin。frataxin结合的铁含量用菲咯嗪分光光度法测定。　　 (2)Frataxin对质粒DNA的抗氧化损伤的保护作用,提取pBR322质粒,电泳鉴定其结构状态完好,这些质粒DNA将与不同浓度的Frataxin和Fe2+、H2O2混合,37℃孵育30分钟,通过琼脂糖电泳来分析DNA氧化损伤情况。　　 (3)frataxin抑制铁诱导自由基的产生,将不同浓度的frataxin与DTT,Fe2+,2-脱氧核糖在37℃孵育10分钟,然后加入0.5mM的过氧化氢继续反应25分钟,之后取600ul反应液与400ul含1％的硫代巴比士酸和2.8％的三氯乙酸的显色液混合,煮沸15min,14000rpm离心15min取上清用DU-800在532nm检测其吸光度,以不加铁的作为空白对照。　　 结果:　　 1.原核表达载体的构建测序结果表明原核表达载体pET28b(+)-FXN与设计一至,工程菌E.coli BL21/pET28b(+)-FXN在适当的条件下诱导表达后,经SDS-PAGE电泳鉴定在19KD处产生一个特异的条带。工程菌E.coli BL21/pET28b(+)-hIscA在适当的条件下诱导表达后,经SDS-PAGE电泳鉴定在16KD处产生一个特异的条带,对其仝波长扫描证明表达载体构建正确。　　 2.表达上清中frataxin与hIscA的纯化与Apo-FXN与Apo-hIscA的制备frataxin与hIscA蛋白经过镍柱亲和层析和Gr-25脱盐柱脱盐后,通过电泳鉴定,其纯度均在95％以上,frataxin能被抗His-tag小鼠单克隆抗体识别。脱铁后的frataxin与hIscA用菲咯嗪分光光度法榆测,几乎不含有任何铁,即得到Apo-FXN与Apo-hIscA。　　 3.Frataxin活性的检测　　 (1)检测结果表明frataxin在没有过氧化氢的条件下,几乎不结合铁,加入过氧化氢后,frataxin与铁结合活性明显增强,并随着加入的铁的浓度升高而增加。　　 (2)电泳图显示过氧化氢与铁同时存在时对超螺旋结构的质粒DNA损伤情况明显,而加入frataxin的反应液中,损伤作用明显减弱,基本维持了质粒原来的超螺旋结构。　　 (3)扫描检测结果显示,当加入frataxin的浓度一定的时候,铁引发的自由基的生成量随着铁的浓度升高而增加,最后会达到一极限值,当铁的浓度一定的时候,加入frataxin的浓度逐渐增加,自由基的生成量明显减弱,而铁硫蛋白hIscA的抑制作用却明显弱于frataxin。　　 结论:　　 我们成功构建了原核表达载体,分离纯化了有活性的frataxin蛋白和hIscA蛋白,检测到氧化压力对frataxin与铁作用效果的影响,为进一步研究体内frataxin转运铁的机制奠定基础。