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在当前全球能源和环境向人类提出挑战之时,开发利用可再生性资源已成为人类发展中的紧迫课题。本论文首先从堆肥、麦秸垛、土壤中采样90多份,利用刚果红纤维素培养基,结合摇瓶产酶试验进行初筛,用麦秸粉固体发酵培养基复筛,共得剑7株分解纤维素能力较强的木霉和曲霉。固体发酵结果显示:该7株野生型菌的滤纸酶活力均高于同批发酵的对照菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)QM9414和康宁木霉(Trichoderma koningii)AS3.2774。对其中一株小霉D-124进行形态特性分析和18s rDNA序列分析,初步鉴定该菌株为绿色木霉(Trichoderma viride)。
从大豆丁香假单胞菌(Pseudomonase syringae pv.glycinea)ICMP2189中克隆乙烯形成酶基因(efe),将其插入剑丝状真菌表达载体pTRIL(携带有纤维二糖酶基因chb I的启动子和终止子)上形成重组质粒pTRIL-efe。然后将携带潮霉素抗性的质粒pAN7-1和重组质粒pTRIL-efe共转化T. viride的原生质体。在含有潮霉素的再生培养基上筛选转化子,经乙烯含量测定和PCR扩增筛选得剑一个刚性T.viride转化子,并通过southern杂交实验进一步证实,乙烯形成酶基因efe是以单拷贝的形式整合到T. viride的基因组中。将转化子培养在以纤维素为唯一碳源的基本培养基上48h后,用气相色谱仪测得乙烯产量为:1.059μL·g<-1>.h<-1>。接着我们测定了不同碳源和氮源及不同含量对T. viride转化子产乙烯的作用,结果表明培养基中的纤维素含量为2%时,乙烯产量最高;向培养基中添加蛋白胨可以提高乙烯的产量;以乳糖和羧甲基纤维素钠作为诱导培养基的碳源时,乙烯的产量相对较低;而向诱导培养基中添加乙烯合成底物2-酮戊二酸(2-oxoglutarate)时效果不太明显。通过上述实验,我们确定了T. viride转化子产乙烯的最优培养基配方为(g·L<-1>):纤维素粉20,蛋白胨2,(NH<,4>)<,2>SO<,4>5,KH<,2>PO<,4> 15,MgSO<,4> 0.6,CaCl<,2> 0.6,FeSO<,4>·7H<,2>O 0.005,MnSO<,4>·H<,2>O 0.0016,ZnSO<,4>·7H<,2>O0.0014,CoCl<,2>0.002。进一步实验发现,T. viride转化子在静置培养条件下的乙烯产量高于摇床培养。当以小麦秸秆为原料进行固体发酵48h,测得乙烯的产量为2.28μL/瓶,说明T.viride转化子可以直接将农业废弃物转化为乙烯。