铜是人体必需的微量元素之一。铜转运蛋白家族(SLC31)对调控体内铜离子的吸收、转运和代谢起着重要的作用。人铜转运蛋白1(h Ctr1)以三聚体的形式存在于脂膜内,对铜离子有高亲和力,主要负责将胞外的铜离子运输到胞内。该蛋白主要由三部分组成,包括位于胞外的N端区域、三个假定的跨膜区域和一个位于胞质内的C端区域。胞外的N端区域含有两个蛋氨酸富集区和两个组氨酸富集区,对h Ctr1与金属离子的结合起重要作用;三个跨膜区构成传输通道,其中含有“150MXXX154M”特征基序的第二跨膜区(TMD2)位于三聚体通道的内侧,对通道的结构和功能至关重要。h Ctr1不但能够传输铜离子,也参与了银离子的转运过程。人铜转运蛋白2(h Ctr2)是铜的低亲和力转运体,主要位于核内体/溶酶体囊泡的膜上,可以把胞液中的铜离子释放到胞质中。还有少量h Ctr2位于质膜上,与h Ctr1一起负责将胞外的铜离子转运到胞内。h Ctr2与h Ctr1具有41%的氨基酸同源性,因此人们推断h Ctr2在膜内的拓扑结构可能与h Ctr1相似,但是尚无实验证据。与h Ctr1一样,h Ctr2也可以结合银离子。与h Ctr1相比,h Ctr2蛋白的N端结构域要短很多,并且只在N端顶端包含一个蛋氨酸富集区(1M-X-3M),这可能使得h Ctr2的N端结合Cu/Ag的能力减弱。而h Ctr2的第二跨膜区高度保守,并且也含有“MXXXM”特征基序。由于第二跨膜区在h Ctr1和h Ctr2的通道结构和传输功能中的关键作用,以及N端区域在蛋白结合铜/银离子中的重要作用,本论文中我们研究了h Ctr1和h Ctr2的第二跨膜区肽片段以及h Ctr2的N端区域肽片段的结构、聚集状态及与银的相互作用的化学计量比、结合常数和热力学参数。我们选用了十二烷基硫酸钠(SDS)作为膜模拟环境,研究中采用了核磁共振、圆二色谱、等温滴定量热法和凝胶电泳等技术。为了解MXXXM片段在h Ctr1-TMD2功能中所起的作用,我们也对各种M-L突变体进行了研究。通过研究,我们得到了以下主要结果。1.h Ctr1-TMD2在SDS胶束中会形成三聚体结构,其中每个单体都是以?-螺旋结构存在的。TMD2三聚体能够与银离子结合,肽段与银离子结合的化学计量比为3:2。TMD2的C端MXXXM区域参与了肽段与银离子的结合,其中两个蛋氨酸(位于肽段序列的20和24位)通过硫醚键直接参与了配位。三聚体中两个位置的蛋氨酸很可能与银离子形成了两个三齿的环形配位。除蛋氨酸外,C端区域的其它极性残基也可能参与了配位。与银结合后肽段的空间结构没有发生明显的改变。当h Ctr1-TMD2的蛋氨酸富集区上任意一个蛋氨酸残基突变为亮氨酸残基或两个蛋氨酸同时突变为亮氨酸后都会导致肽段的聚集程度的降低及与银结合能力的下降,表明第二跨膜区上MXXXM特征片段对肽段三聚体的形成以及与银离子结合的能力都非常重要。2.h Ctr2-TMD2在SDS胶束中也形成了?-螺旋结构,其聚集状态与肽段/SDS比相关。在肽段/SDS=1:120时,肽段形成二聚体结构,而当肽段/SDS比增加到1:20时,肽段则形成了三聚体结构。不论是形成二聚体还是三聚体,肽段都能与银离子结合,并主要由两个蛋氨酸残基提供配位。肽段的二聚体与银离子结合的化学计量比为1:1,而肽段的三聚体与银结合的计量比为3:2,得到的结合常数表明h Ctr2-TMD2三聚体结合银离子的能力大于二聚体。通过对比h Ctr1-TMD2和h Ctr2-TMD2的实验结果我们发现,在相同的肽段/SDS比时,不仅h Ctr2-TMD2肽段聚集能力低于h Ctr1-TMD2肽段,而且h Ctr2-TMD2三聚体对银的亲和力也弱于h Ctr1-TMD2肽段。两个TMD2三聚体对银离子亲和力的不同与相应的两个完整蛋白结合一价铜离子能力的差别相一致(一价银离子与一价铜离子等电位)。3.h Ctr2的N端区域肽段在SDS胶束溶液中形成了以β-折叠为主导的构象,并能够与银离子结合,与银离子结合后肽段的二级结构几乎没有发生改变;而在不含胶束的水溶液中肽段形成以无规卷曲为主导的结构,与银离子结合后肽段的无规卷曲结构减少,β-折叠结构增加;在这两种体系中,肽段与银的结合都是通过N端的两个蛋氨酸进行配位的;改变溶液的p H值对肽段的二级结构几乎没有影响,但是对肽段与银的结合方式和结合能力有一定的影响。本论文中的研究为进一步了解铜转运蛋白的结构与功能的关系及离子传输机理提供了相关信息。