缺血性脑卒中是严重危害人类健康的常见病和多发病。脑缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤是缺血性脑卒中重要的病理生理进程,严重影响其临床治疗和预后。细胞自噬是通过降解细胞内有害蛋白与受损细胞器而维持细胞代谢平衡的主要机制,在脑I/R损伤的病程进展和预后中发挥重要作用。AMPK/ULK1信号通路能够感受细胞内能量变化,并且是调控细胞自噬启动的关键途径。补阳还五汤是中医治疗气虚血瘀型脑卒中的经典方剂,对缺血性脑卒中急性期和恢复期均有显著疗效。补阳还五汤具有益气、活血、通络的功效,可使气旺促血行,恢复机体气血阴阳平衡,与细胞自噬在维持细胞代谢平衡方面异曲同工。然而细胞自噬是否在补阳还五汤抑制脑缺血再灌注损伤过程中发挥重要作用,以及具体的调控途径如何,AMPK/ULK1信号通路是否参与其中,目前尚不清楚。因此,本课题从在体和离体两个水平探究了补阳还五汤是否通过调控自噬减轻脑I/R损伤,并在离体水平上进一步探讨了AMPK/ULK1信号通路是否参与补阳还五汤对自噬的调控过程。本课题分别采用成年Sprague Dawlay（SD）大鼠和原代大鼠皮层神经元建立模型模拟脑I/R损伤过程,研究共分为三个部分:1.补阳还五汤减轻脑缺血再灌注损伤的作用研究;2.补阳还五汤抑制自噬减轻脑缺血再灌注损伤的机制研究;3.补阳还五汤通过AMPK/ULK1信号通路抑制自噬减轻脑缺血再灌注损伤的机制研究。第一部分补阳还五汤减轻脑缺血再灌注损伤的作用研究目的:探究补阳还五汤减轻脑I/R损伤的作用,并筛选出最佳作用条件。方法:在体水平上将成年SD大鼠随机分为假手术（Sham）组、模型（I/R）组和补阳还五汤治疗（I/R+BHD）组。采用大脑中动脉栓塞/再灌注（middle cerebral artery occulusion/reperfusion,MCAO/R）模型模拟脑I/R损伤,缺血2 h后再灌注1 d、3 d和7 d。通过TTC染色法检测大鼠脑梗死体积,TUNEL染色法检测细胞凋亡率,尼氏染色观察神经元损伤。摸索补阳还五汤减轻大鼠MCAO/R损伤的最佳作用条件。离体水平上提取大鼠皮层神经元,原代培养至7 d,首先摸索神经元缺氧缺糖/复氧复糖（oxygen and glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）模型建立条件。将神经元随机分为正常对照（Control）组、模型（OGD/R）组。模型组神经元分别进行缺氧缺糖1 h、2 h、3 h、4 h复氧复糖24 h。通过CCK-8法检测神经元存活率、LDH法检测LDH释放率,来确定神经元OGD/R模型建立条件。其次在确定的OGD/R模型条件上,将神经元随机分为正常对照（Control）组、模型（OGD/R）组、模型+补阳还五汤含药血清（BHDS）组（1%、3%、5%、10%）、模型+空白血清对照（CS）组（1%、3%、5%、10%）。通过CCK-8法检测神经元存活率,摸索补阳还五汤含药血清的最佳作用浓度。最后,用补阳还五汤含药血清的最佳浓度干预OGD/R损伤的神经元,通过倒置显微镜观察神经元形态变化,流式细胞术检测神经元凋亡率,进一步明确补阳还五汤含药血清对OGD/R神经元的保护作用。结果:1.在体实验:1.1补阳还五汤对大鼠脑梗死体积的影响:Sham组大鼠脑组织未出现梗死灶。1 d、3 d和7 d的I/R组大鼠左侧脑组织均出现明显的梗死灶（P＜0.01）。与I/R组相比,经3 d（P＜0.01）和7 d（P＜0.05）补阳还五汤灌胃处理的I/R+BHD组大鼠脑梗死体积均显著减小。再灌注3 d的I/R组与I/R+BHD组的组间差异稍大于7 d组。1.2补阳还五汤对大鼠脑组织神经细胞凋亡的影响:Sham组大鼠脑组织细胞凋亡少见。与Sham组相比,1 d、3 d、和7 d的I/R组大鼠左侧脑组织神经细胞凋亡率显著升高（P＜0.01）。经补阳还五汤灌胃3 d和7 d的I/R+BHD组大鼠左侧脑组织神经细胞凋亡率均显著降低（P＜0.01）。再灌注3 d的I/R组与I/R+BHD组的组间差异稍大于7 d组。1.3补阳还五汤对大鼠脑神经元损伤的影响:Sham组大鼠脑组织皮层神经元形态完整、尼氏小体深染且神经细胞损伤率很低。与Sham组相比,1 d、3 d和7 d的I/R组大鼠左侧脑组织皮层神经元缩小、甚至死亡,神经细胞损伤率显著升高（P＜0.01）。与I/R组相比,经补阳还五汤灌胃3d和7 d的I/R+BHD组大鼠神经元形态均有明显改善,且神经细胞损伤率均显著降低（P＜0.01）。再灌注3 d的I/R组与I/R+BHD组的组间差异稍大于7 d组。2.离体实验:2.1原代大鼠皮层神经元的状态观察与纯度鉴定:神经元提取后培养1-7 d,生长状态良好。到第7 d神经元胞体饱满、折光性强,细胞间形成丰富均匀的突触网络。经Neu N染色和NSE染色两种方法鉴定神经元纯度均大于95%。2.2神经元OGD/R模型的建立:与Control组相比,缺氧缺糖1 h、2 h、3 h、4 h,复氧复糖24 h后神经元存活率均显著下降（P＜0.01）,LDH漏出率均显著升高（P＜0.01）,且随着缺氧缺糖时间的增加,神经元存活率逐渐降低,LDH漏出率逐渐升高,呈现时间依赖性。其中缺氧缺糖3 h,复氧复糖24 h时,神经元的存活率和LDH漏出率最接近细胞半数抑制率,因此,选择该时间点建立OGD/R模型。2.3补阳还五汤含药血清作用浓度的摸索:与Control组相比,OGD/R组神经元存活率显著降低（P＜0.01）。经1%BHDS（P＜0.05）、3%BHDS（P＜0.01）、3%CS（P＜0.01）干预后的OGD/R神经元存活率均显著升高,5%BHDS、5%CS、10%BHDS、10%CS干预的OGD/R神经元存活率均显著降低（P＜0.01）,1%CS干预后神经元存活率无显著性改变。3%BHDS组神经元存活率显著高于3%CS组（P＜0.01）,1%BHDS组与1%CS组间神经元存活率无显著性差异（P＞0.05）。因此,选择3%补阳还五汤含药血清用于后续研究。2.4补阳还五汤含药血清对OGD/R神经元的保护作用2.4.1补阳还五汤含药血清对OGD/R神经元形态的影响:Control组神经元胞体立体、饱满、折光性强,形成均匀密集的神经网络;OGD/R组神经元肿胀甚至崩解,突触减少、断裂。经3%BHDS干预的OGD/R神经元胞体肿胀程度减轻,突触明显增多,在神经元间形成连接。3%CS干预的OGD/R神经元同样胞体肿胀程度减轻,突触有所增多,个别神经元之间形成连接,但不及3%BHDS组改善效果显著。2.4.2补阳还五汤含药血清对OGD/R神经元凋亡率的影响:与Control组相比,OGD/R组神经元凋亡率显著升高（P＜0.01）;BHDS与CS干预后OGD/R神经元凋亡率显著降低（P＜0.01）;且BHDS组神经元凋亡率显著低于CS组（P＜0.05）。小结:补阳还五汤能够显著减小大鼠脑梗死体积、神经细胞凋亡率,改善神经元损伤情况,减轻大鼠脑I/R损伤。其中,脑缺血2 h再灌注3 d,并在再灌注同时给予补阳还五汤干预是最佳作用条件。补阳还五汤含药血清能够显著增加OGD/R神经元存活率,改善细胞形态,降低细胞凋亡率,对OGD/R神经元发挥保护作用。其中缺氧缺糖3 h复氧复糖24 h,并在复氧复糖同时给予3%补阳还五汤含药血清干预是最佳作用条件。第二部分补阳还五汤抑制自噬减轻脑缺血再灌注损伤的研究目的:探究细胞自噬在脑I/R损伤中的具体作用以及补阳还五汤是否通过调控自噬来减轻脑I/R损伤。方法:在体水平上将SD大鼠随机分为假手术（Sham）组、模型（I/R）组和补阳还五汤治疗（I/R+BHD）组。I/R组和I/R+BHD组建立MCAO/R模型,缺血2 h,再灌注3 d。I/R+BHD组在再灌注的同时给予大鼠补阳还五汤（14.3 g/kg）灌胃处理。Western Blot法检测大鼠脑缺血中心区、半影区和对侧区的自噬蛋白Beclin-1和LC3B的表达水平,并用透射电镜观察半影区神经元的损伤和自噬发生情况。离体水平上将神经元随机分为正常对照（Control）组、模型（OGD/R）组、自噬抑制剂（3-MA）组（3 mmol/L）、自噬激活剂（Rapa）组（500 nmol/l）、补阳还五汤含药血清（BHDS）组（3%）、补阳还五汤含药血清+自噬激活剂（BHDS+Rapa）组。神经元经缺氧缺糖3 h复氧复糖24 h建立OGD/R模型。通过Western Blot法检测神经元Beclin-1和LC3B蛋白表达,流式细胞术检测神经元自噬小体CYTO-ID染色荧光强度,免疫荧光双标法检测神经元LC3B荧光强度和形态变化,CCK-8法检测神经元存活率,流式细胞术检测神经元凋亡率。结果:1.在体实验:1.1补阳还五汤对大鼠脑缺血再灌注损伤后不同损伤区域自噬相关蛋白水平的影响:中心区I/R组Beclin-1表达与Sham组相比明显降低（P＜0.05）,与I/R+BHD组间无显著性差异（P＞0.05）;LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ的转化在三组中均无显著性差异。半影区I/R组Beclin-1的表达及LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ的转化均比Sham组显著增加（P＜0.01）;与I/R组相比,I/R+BHD组Beclin-1的表达以及LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ的转化均显著降低（P＜0.05）。对侧区Beclin-1的表达及LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ的转化在三组间均无显著性差异（P＞0.05）。1.2透射电镜观察补阳还五汤对大鼠半影区皮层神经元损伤和自噬情况的影响:Sham组神经元结构完整,未发现典型自噬。I/R组神经元胞膜受损,水肿严重,可见较多的脂褐素和自噬小体。I/R+BHD组神经元水肿程度有所改善,自噬溶酶体个别存在。I/R+BHD组自噬程度低于I/R组。2.离体实验:2.1补阳还五汤含药血清对OGD/R神经元自噬蛋白表达的影响2.1.1各组神经元Beclin-1表达情况:OGD/R神经元Beclin-1水平比Control组显著升高（P＜0.01）;与OGD/R组比较,3-MA组（P＜0.01）和BHDS组（P＜0.05）显著降低,Rapa组显著升高（P＜0.01）;BHDS+Rapa组较Rapa组显著下降（P＜0.05）,但仍显著高于BHDS组（P＜0.05）。2.1.2各组神经元LC3B表达情况:OGD/R损伤后的神经元LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ的转化比Control组显著增加（P＜0.01）;3-MA组（P＜0.05）和BHDS组（P＜0.05）与OGD/R组相比均显著减少,Rapa组显著增加（P＜0.05）;BHDS+Rapa组较Rapa组显著减少（P＜0.01）,但仍显著高于BHDS组（P＜0.05）。2.2补阳还五汤对OGD/R神经元内自噬小体形成的影响:与Control组相比,OGD/R组神经元CYTO-ID荧光强度显著增强（P＜0.01）;3-MA组、BHDS组荧光强度较OGD/R组显著减弱（P＜0.01）,Rapa组显著增强（P＜0.01）;BHDS+Rapa组荧光强度较Rapa组显著减弱（P＜0.01）,但仍显著强于BHDS组（P＜0.01）。2.3补阳还五汤对大鼠皮层神经元OGD/R后LC3B荧光强度及神经元形态的影响:Control组神经元LC3B荧光强度低,神经元突触丰富,形成神经网络。OGD/R损伤的神经元LC3B荧光强度显著升高（P＜0.01）,突触数量明显减少且平均长度缩短。与OGD/R组相比,3-MA组（P＜0.01）和BHDS组（P＜0.05）神经元LC3B荧光强度均显著降低,神经元形态有所改善,突触数量有所增多,BHDS组神经元间形成少量突触网络;Rapa组神经元LC3B荧光强度显著增多（P＜0.05）,神经元突触数量减少且缩短;BHDS+Rapa组神经元LC3B荧光强度较Rapa组显著降低（P＜0.01）,但仍显著高于BHDS组（P＜0.05）,神经元形态较Rapa组稍有改善。2.4补阳还五汤调控自噬对OGD/R神经元存活率的影响:与Control组相比,OGD/R组神经元存活率显著降低（P＜0.01）。与OGD/R组神经元存活率相比,3-MA组和BHDS组均显著升高（P＜0.01）,Rapa组显著降低（P＜0.01）。BHDS+Rapa组神经元存活率较Rapa组显著降低（P＜0.01）,但仍显著高于BHDS组（P＜0.01）。2.5补阳还五汤调控自噬对OGD/R神经元凋亡的影响:与Control组相比,OGD/R组凋亡率显著升高（P＜0.01）。与OGD/R组凋亡率相比,3-MA组和BHDS组均显著降低（P＜0.01）,Rapa组显著升高（P＜0.01）。BHDS+Rapa组神经元凋亡率较Rapa组显著降低（P＜0.01）,但仍显著高于BHDS组（P＜0.01）。小结:补阳还五汤能够显著降低大鼠脑缺血半影区神经元自噬蛋白Beclin-1表达、LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ的转化以及自噬小体的数量,减轻脑I/R损伤。补阳还五汤含药血清能够显著降低OGD/R损伤后神经元Beclin-1表达、LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ的转化、自噬小体的水平和LC3B荧光强度,改善神经元形态,降低神经元凋亡率,提高存活率,对OGD/R神经元发挥保护作用。第三部分补阳还五汤通过AMPK/ULK1信号通路抑制自噬减轻脑缺血再灌注损伤的研究目的:探究AMPK/ULK1信号通路在神经元OGD/R损伤中发挥的作用,以及补阳还五汤是否通过该通路调控自噬以减轻脑I/R损伤。方法:建立神经元OGD/R模型,将神经元随机分为正常对照（Control）组、模型（OGD/R）组、AMPK抑制剂（Compound C）组（2μmol/L）、AMPK激活剂（AICAR）组（3mmol/L）。通过Western Blot法检测神经元p-AMPK、AMPK、p-ULK1、ULK1、Beclin-1的表达情况,免疫双标法检测神经元LC3B荧光斑点强度和形态变化,CCK-8法检测神经元存活率。建立神经元OGD/R模型,将神经元随机分为正常对照（Control）组、模型（OGD/R）组、AMPK激活剂（AICAR）组（3mmol/L）、补阳还五汤含药血清（BHDS）组（3%）、补阳还五汤含药血清+AMPK激活剂（BHDS+AICAR）组。通过Western Blot法检测神经元p-AMPK、AMPK、p-ULK1、ULK1、Beclin-1的表达情况,免疫双标法检测神经元LC3B荧光强度和形态变化,CCK-8法检测神经元存活率。结果:1.AMPK/ULK1信号通路调控自噬参与神经元OGD/R损伤1.1调控AMPK对OGD/R神经元AMPK/ULK1信号通路蛋白的影响:OGD/R损伤后神经元p-AMPK/AMPK显著升高（P＜0.01）。与OGD/R组相比,Compound C组神经元p-AMPK/AMPK显著降低（P＜0.01）,AICAR组显著升高（P＜0.01）。OGD/R损伤后神经元p-ULK1/ULK1显著升高（P＜0.01）。与OGD/R组相比,Compound C组神经元p-ULK1/ULK1显著降低（P＜0.01）,AICAR组显著升高（P＜0.05）。1.2调控AMPK对OGD/R神经元Beclin-1表达的影响:OGD/R损伤后神经元Beclin-1水平显著升高（P＜0.01）。与OGD/R组相比,Compound C组神经元Beclin-1水平显著降低（P＜0.05）,AICAR组显著升高（P＜0.05）。1.3调控AMPK对OGD/R神经元LC3B荧光强度及神经元形态变化的影响:Control组神经元LC3B荧光强度低,形态完整。OGD/R损伤后神经元LC3B荧光强度显著升高（P＜0.01）,突触数量明显减少且长度缩短。与OGD/R组相比,Compound C组神经元LC3B荧光强度显著降低（P＜0.01）,突触数量有所增多;AICAR组神经元LC3B的荧光强度显著增强（P＜0.05）,形态损伤进一步加重。1.4调控AMPK对OGD/R神经元细胞存活率的影响:OGD/R损伤后神经元存活率较Control组显著降低（P＜0.01）。与OGD/R组相比,Compound C组存活率显著升高（P＜0.01）,AICAR组存活率显著降低（P＜0.01）。2.补阳还五汤通过AMPK/ULK1信号通路抑制自噬减轻神经元OGD/R损伤2.1补阳还五汤对OGD/R神经元AMPK/ULK1信号通路蛋白的影响:OGD/R损伤后神经元p-AMPK/AMPK显著升高（P＜0.01）。与OGD/R组相比,BHDS组神经元p-AMPK/AMPK水平显著降低（P＜0.05）,AICAR组显著升高（P＜0.01）。BHDS+AICAR组神经元p-AMPK/AMPK较AICAR组显著降低（P＜0.01）,但仍显著高于BHDS组（P＜0.05）。OGD/R损伤后神经元p-ULK1/ULK1显著增高（P＜0.01）。与OGD/R组相比,BHDS组神经元p-ULK1/ULK1显著降低（P＜0.01）,AICAR组显著升高（P＜0.05）。BHDS+AICAR组神经元p-ULK1/ULK1较AICAR组显著降低（P＜0.01）,但仍显著高于BHDS组（P＜0.05）。2.2补阳还五汤调控AMPK对OGD/R神经元Beclin-1表达的影响:OGD/R损伤后神经元Beclin-1水平显著增高（P＜0.01）。与OGD/R组相比,BHDS组神经元Beclin-1水平显著降低（P＜0.05）,AICAR组显著升高（P＜0.01）。BHDS+AICAR组神经元Beclin-1水平较AICAR组显著降低（P＜0.01）,但仍显著高于BHDS组（P＜0.01）。2.3补阳还五汤调控AMPK对OGD/R神经元LC3B荧光强度及神经元形态变化的影响:Control组神经元LC3B荧光强度低,形态完整。OGD/R损伤后神经元LC3B荧光强度显著升高（P＜0.01）,突触数量明显减少且长度缩短。AICAR组神经元较OGD/R组LC3B的荧光强度显著增高（P＜0.05）,神经元形态损伤进一步加重。BHDS组神经元较OGD/R组LC3B荧光强度显著降低（P＜0.01）,突触的数量和长度均有所改善。BHDS+AICAR组神经元LC3B的荧光强度较AICAR组显著减少（P＜0.01）,且神经元形态有所改善,但LC3B荧光强度仍显著低于BHDS组（P＜0.01）,神经元突触不及BHDS组丰富。2.4补阳还五汤调控AMPK对OGD/R神经元存活率的影响:OGD/R损伤后神经元存活率显著降低（P＜0.01）。与OGD/R组相比,BHDS组存活率显著升高（P＜0.01）,AICAR组神经元存活率显著降低（P＜0.01）。BHDS+AICAR组神经元存活率较AICAR组显著升高,但仍明显低于BHDS组（P＜0.01）。小结:神经元OGD/R损伤后p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1、Beclin-1的水平和LC3B荧光强度均显著升高。抑制AMPK活化水平能够显著降低ULK1活化水平、Beclin-1的表达和LC3B荧光强度,并显著提高神经元存活率,改善神经元形态。激活AMPK的作用则相反。说明AMPK/ULK1信号通路在OGD/R后激活并过度上调自噬水平,损伤神经元。补阳还五汤含药血清可显著降低OGD/R神经元的p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1、Beclin-1的水平和LC3B的荧光强度,并显著提高神经元存活率,改善形态。说明补阳还五汤含药血清可通过AMPK/ULK1信号通路抑制自噬的过度激活,降低自噬水平,从而对OGD/R神经元发挥神经保护作用。结论:1.补阳还五汤能够减少MCAO/R大鼠脑梗死体积、降低神经细胞凋亡率、改善脑组织神经元损伤。补阳还五汤含药血清能够提高OGD/R神经元的存活率、降低凋亡率、改善形态,从而减轻脑I/R损伤。2.补阳还五汤能够降低大鼠脑缺血半影区Beclin-1的表达和LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ的转化,减少自噬小体数量。补阳还五汤含药血清可降低OGD/R神经元Beclin-1的表达和LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ的转化,减少自噬小体荧光染色强度和LC3B荧光强度,提高OGD/R神经元的存活率,并改善神经元形态。因此,补阳还五汤能够抑制自噬过度激活减轻脑I/R损伤。3.补阳还五汤含药血清能够降低OGD/R神经元p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1、Beclin-1的水平和LC3B的荧光强度,并提高存活率,改善形态。因此,补阳还五汤能够通过AMPK/ULK1信号通路抑制自噬减轻脑I/R损伤。