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棉花黄萎病严重影响棉花的产量和品质,阻碍了我国棉花的生产发展。随着分子生物学和基因工程的快速发展,利用生物技术研究棉花抗黄萎病机制和克隆与棉花抗黄萎病相关基因已经成为当前研究热点。本研究利用本课题已构建的黄萎病菌诱导的棉花转录组数据库,结合在棉花D基因组中鉴定的抗病R基因筛选出与棉花抗黄萎病相关的候选抗病基因,并通过荧光定量PCR分析其在黄萎病菌诱导后的表达趋势。从候选抗病基因中选择两个GbDRP66319和GbHIR42734进行基因克隆、生物信息学分析,并通过VIGS技术初步验证其功能。研究结果如下:1、在本课题已经获得与棉花抗黄萎病性状显著关联的分子标记两端800kb范围内寻找含有NBS-LRR类R基因共64个,以R基因比对黄萎病菌诱导的转录组数据库,获得与之高度同源的Unigenes,从中选择显著差异表达的24个Unigenes进行荧光定量PCR,其在黄萎病菌诱导后的表达趋势,结果显示黄萎病菌诱导后相比对照表达量总体呈上调,但是不同基因的表达模式又存在差异。大致可总结为两种情况:一种是诱导4h后上调表达,即瞬时基础防御;另一种情况是在诱导12h后上调表达,即滞后特异性防御。2、本文通过同源基因克隆法,对GbDRP66319和GbHIR42734的编码区进行克隆,测序结果显示GbDRP66319基因的CDS编码区为879 bp,编码292个氨基酸。通过TMHMM软件分析跨膜结构域,该蛋白没有跨膜结构域。GbDRP66319与棉花A和D基因组数据库比对,获得29个同源基因,根据SMART等软件分析保守结构域,结果显示其含有P-loop,Kinase2,Kinase3,GLPL and MHDL五个motifs,以及LRR_BAC,LRR_CC和LRR_TYP等抗病基因的保守结构域。GbHIR42734 CDS编码区为855 bp,编码284个氨基酸。通过TMHMM软件分析跨膜结构域,该蛋白没有跨膜结构域。GbHIR42734与棉花A和D基因组数据库比对,获得6个同源基因,该类蛋白均含有植物过敏反应诱导的家族蛋白的保守结构域SPFH(Stomatins、Prohibitin、Flo-tillins、Hflk/C)结构域和PHB(Prohibitin homologues)。3、对GbDRP66319和GbHIR42734进行组织特异性表达分析发现,GbDRP66319在黄萎病菌诱导12h后抗病品种的下胚轴和子叶中的表达量显著高于感病品种,并在抗病品种各组织中下胚轴表达量显著最高。GbHIR42734在黄萎病菌诱导12h后的抗病品种根部表达量显著高于感病品种,并且在抗病品种各组织中根部表达量最高。4、通过构建GbDRP66319和GbHIR42734的VIGS沉默载体,在农杆菌GV3101的介导下侵染棉花植株。然后用黄萎病菌Vd080接菌,结果显示,GbDRP66319和GbHIR42734沉默表达的植株比对照植株发病较重,初步验证GbDRP66319和GbHIR42734在棉花抗黄萎病中发挥一定作用。