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β—甘露聚糖酶(EBM)是降解甘露聚糖或含甘露聚糖的多糖的水解酶之一。植物种子的萌发涉及胚乳细胞壁的降解,而甘露聚糖是普遍存在于植物细胞壁中的一种半纤维素成分,所以胚乳细胞壁发生降解也会涉及甘露聚糖降解。因此β—甘露聚糖酶可能与植物种子萌发过程中胚乳细胞壁的降解有关。拟南芥是植物研究中的模式植物,但由于拟南芥种子过小,操作的不可行性使得拟南芥种子不能成为研究种子萌发过程中胚乳弱化的材料。独行菜(Lepidium sativum)跟拟南芥同属十字花科,两者亲缘关系较近,种子结构相似,但独行菜种子较拟南芥种子大,操作的可行性是本文采用独行菜(Lepidium sativum)为材料的理由。本文从独行菜β—甘露聚糖酶酶活、β—甘露聚糖酶基因克隆、基因表达水平等角度,研究β—甘露聚糖酶与独行菜种子萌发过程中胚乳弱化的关系。结果总结如下:
根据NCBI上已发表的其它植物物种中β—甘露聚糖酶基因的序列,本研究设计了简并引物,从独行菜种子中克隆得到β—甘露聚糖酶基因片段,并通过快速扩增cDNA末端(RACE)得到独行菜种子β—甘露聚糖酶基因全长,继而从基因水平上探讨β—甘露聚糖酶基因与独行菜种子萌发过程中胚乳弱化的关系。
用凝胶扩散法对独行菜种子在萌发过程中各组织部位(子叶、胚根、珠孔端胚乳、非珠孔端胚乳)进行β—甘露聚糖酶酶活测定,本文结果发现,独行菜种子中的四个部位均检测到β—甘露聚糖酶酶活,子叶和胚根中活性较珠孔端胚乳和非珠孔端胚乳大,而子叶中β—甘露聚糖酶酶活在吸水24 h之前较低,24 h后迅速上升并始终维持一个较高水平;胚根在整个萌发过程中都维持较高的酶活性,并在20至24 h出现一个酶活峰,随后活性略为下降;珠孔端胚乳和非珠孔端胚乳中β—甘露聚糖酶酶活随着萌发进行逐渐增大,并在18 h到30h出现活性高峰,随后活性下降。
根据克隆得到的独行菜种子β—甘露聚糖酶基因全长,设计引物,运用半定量PCR方法,研究了β—甘露聚糖酶基因在独行菜种子萌发过程中各组织部位的表达水平。结果表明,独行菜种子子叶在吸水30 h前β—甘露聚糖酶基因表达量低,30 h后明显增加;胚根在萌发过程中保持较高的表达水平,并在20至24 h出现表达量的增加,随后也维持较高的表达水平;珠孔端胚乳在种子萌发过程中β—甘露聚糖酶基因表达量逐渐增加,并在18至30h出现表达量的高峰,随后表达量下降;非珠孔端胚乳在种子萌发过程中β—甘露聚糖酶基因表达量逐渐增加,并在18至36h出现表达量的高峰,随后表达量下降。
从独行菜种子中β—甘露聚糖酶酶活性及基因表达模式推测,在珠孔端胚乳中的β—甘露聚糖酶与独行菜种子萌发过程中胚乳弱化相关,并促进独行菜种子胚乳弱化及萌发。