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目的:
膀胱癌是我国最常见的泌尿系统肿瘤，单纯手术切除后复发率高，手术切除结合膀胱内抗癌药物灌注是治疗膀胱癌最经典的方法。然而化疗药物存在着毒副作用大、不同程度的耐药以及对癌细胞的杀伤缺乏靶向性等缺点。因此研究新的治疗方法，开发高效低毒的治疗药物，成为目前研究的热点。
CD40配体(CD40L)是主要存在于活化的CD4+T淋巴细胞表面的Ⅱ型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子超家族成员，它与广泛表达于包括B细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞的免疫细胞表面的CD40相互作用是是免疫应答的中心环节，为B淋巴细胞活化提供必需的协同刺激信号。肿瘤细胞上活化的CD40可以直接抑制癌细胞生长并促进凋亡，还能刺激DCs活化增强抗肿瘤免疫反应。在小鼠原位膀胱癌模型中，证实了CD40L的原位基因治疗能成功的抑制肿瘤细胞的生长。
我们通过制备链亲和素标记的可溶性CD40L双功能融合蛋白，旨在利用细胞表面蛋白质的氨基易生物素化以及链亲和素和生物素强有力的结合的特性将CD40L直接锚定于生物素化的肿瘤细胞表面而发挥其更持久、更有效抗肿瘤的作用。与此同时，我们期望能建立一种简单、高效、安全的蛋白质锚定技术来治疗表浅膀胱癌。
方法:
1.6His-SA-L-sCD40L-pET24表达质粒的构建
用RNA提取试剂盒从经ConA刺激的小鼠脾脏细胞中提取总RNA。通过RT-PCR扩增编码小鼠sCD40L的cDNA。用S．avidinii基因组DNA作为模板PCR获得编码链霉亲和素(SA)的DNA，最后将这两个PCR产物克隆到pET24a质粒的NdeI和XhoI酶切位点之间。该重组质粒cDNA表达的融合蛋白的N端设有6-His标记。
2．SA-sCD40L融合蛋白的表达
将6His-SA-L-sCD40L-pET24重组质粒转化入BL21感受态细胞中，挑取阳性克隆进行活化。震荡培养至OD600≈0.6加入终浓度为1mMIPTG诱导表达4小时，超声破菌，包涵体洗涤。应用SDS-PAGE分析检测表达产物。
3．SA-sCD40L融合蛋白的纯化、复性
包涵体经过洗涤后用8M尿素溶解，先经0.45um孔径膜过滤后利用镍柱亲和层析柱进行纯化，使用梯度透析法复性融合蛋白，最后用2-亚氨基生物素-琼脂糖柱纯化复性后的蛋白，使用SDS-PAGE、Westernblot及凝胶成像扫描方法验证蛋白并分析纯化产物的纯度。
4．体外检测SA-sCD40L融合蛋白的生物活性
将复性后的SA-sCD40L融合蛋白调整为不同浓度于体外检测是否对淋巴细胞有促增殖效应，并应用流式细胞仪检测SA-sCD40L对膀胱癌细胞MB49的锚定率，初步评价该融合蛋白的生物学活性。
5．SA-sCD40L融合蛋白在表浅膀胱癌灌注疗法中的应用
建立小鼠正位膀胱癌模型，从建模后的第3天开始治疗，生物素化半小时后灌注融合蛋白，同时设立sCD40L、SA-GFP和PBS对照组，治疗每周两次，共三周，观察小鼠的生存期。在治疗结束后的30天，分别收集治疗组治愈和荷瘤的小鼠，应用LDH试剂盒进行淋巴细胞杀伤试验。为了解融合蛋白在膀胱粘膜的锚定时间，分别在2，4，6天摘取融合蛋白治疗小鼠的膀胱，进行免疫组织化学检测。冰冻切片后，应用仓鼠抗小鼠SCD40L单克隆抗体孵育，酶标抗仓鼠二抗检测，DAB显色，苏木素复染。
结果:
1．重组质粒的构建
构建的质粒经DNA序列测定，包含6His、SA、连接肽基因和sCD40L，经序列比对准确无误，无读码错误。
2．融合蛋白的表达、纯化
将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21，经筛选获得表达工程菌，在37℃，250rpm摇床震荡培养至OD≈0.6，加IPTG诱导4小时，目的蛋白的表达量占总蛋白量的15-20％，主要以包涵体形式表达。经镍金属螯合层析及2-Iminobiotin亲和柱层析后，融合蛋白的纯度达到95％。
3．融合蛋白的生物学活性检测
经流式细胞学检测，融合蛋白能够锚定于生物素化的肿瘤细胞表面，锚定率达98％，而未生物素化的肿瘤细胞锚定率仅有3％。SA-sCD40L融合蛋白的生物学活性较重组鼠sCD40L活性强。取小鼠脾细胞，体外MTT法检测发现不同浓度的SA-sCD40L促B淋巴细胞增殖成剂量依赖关系。
4．融合蛋白灌注疗法在表浅膀胱癌中的应用
植入MB49肿瘤细胞60天之后，PBS处理组和sCD40L处理组的所有小鼠死亡，SA-GFP组小鼠有80％死于肿瘤。相反，SA-sCD40L锚定治疗组小鼠有50％未见肿瘤生长。在肿瘤特异性杀死试验中，SA-sCD40L治疗组未生长肿瘤的小鼠的杀伤率在效靶比为1:1，25:1，50:1为11％，25％，35％，在sCD40L组中对应的杀伤率为4％，7％，12％，在SA-GFP组中为6％，9％，13％，在PBS组中为5％，7％，11％。
免疫组化分析显示SA-sCD40L可以固定于生物素化膀胱壁粘膜表面达4天以上。新生的膀胱上皮可有效替代灌注后意外损害的膀胱上皮，因为这种上皮是没有被生物素化，所以黏膜表面不会被染色。SA-sCD40L处理组小鼠肿瘤部位比其它组小鼠有更多的CD4T细胞和CD8T细胞浸润。
结论:
1．成功构建了SA-sCD40L-pET24a表达质粒
2．SA-sCD40LpET24a表达质粒导入BL21宿主菌，经诱导表达后，成功获得了SA-sCD40L融合蛋白的表达。
3．SA-sCD40L融合蛋白具有链亲和素和sCD40L的双重生物学活性：
4．SA-sCD40L融合蛋白可以锚定于膀胱粘膜表面，发挥其抗肿瘤的作用。