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研究背景:急性心肌梗死是世界范围内死亡和致残的主要原因。虽然早期再灌注是挽救缺血心肌最有效的方法,但血流恢复可诱发病理事件,从而导致反常的缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤。虽然有大量的基础研究和临床研究来减少I/R损伤的不良后果,但结果并不令人满意。现有研究表明,心肌I/R期间氧化应激水平的升高对I/R损伤的严重程度起着核心作用。氧化应激引起活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的升高,不仅直接导致心肌的氧化损伤(如脂质过氧化、DNA/RNA碱基氧化等),也通过影响钙信号和激酶等对心脏收缩功能和心肌细胞存活产生不利影响。同时,内质网是细胞内蛋白质加工的主要场所和细胞内最重要的钙库,I/R期间大量ROS的产生破坏其内特殊的氧化还原环境和Ca2+稳态,加剧内质网应激和功能障碍。此外,I/R期间,过量的ROS促进多种炎症介质的产生,通过刺激组织炎症加剧I/R损伤。ROS的过度产生可以激活一系列细胞内信号通路,如导致氧化还原敏感的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的激活,包括p38 MAPK、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)和c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)及其下游信号级联,通过多种效应加剧心肌I/R损伤。虽然氧化应激是心肌I/R损伤的关键机制,但心血管疾病抗氧化治疗的结果令人失望,一些具有显著有益效果的临床前治疗在临床转化中没有显示出明显的益处。尚不清楚为什么这些研究没能使临床患者获益;但显然目前抑制内源性ROS生成或补充外源性抗氧化剂以干预氧化应激的策略可能无效。因此,增强内源性抗氧化能力可能是一种更有效的干预方法,使寻找有效的内源性抗氧化靶点成为当前研究的重点。Sestrin2(Sesn2)作为一种应激诱导蛋白,是调节ROS产生的关键因子。在包括缺血和再灌注损伤等多种应激状态下,Sesn2通过激活AMP依赖的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)和核转录因子NE-F2相关因子2,以及抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1等,发挥重要的细胞和组织保护作用。我们课题组的前期研究发现,Sesn2作为支架蛋白促进缺血心脏中肝激酶B1介导的AMPK激活,并通过调控AMPK/PGC-1α信号通路在心肌缺血梗死期间保护线粒体功能,抑制缺血所致的心肌细胞凋亡;在心肌I/R期间,Sesn2通过促进AMPK活化,调节心脏底物代谢,增加心肌对I/R损伤的耐受性。此外,有研究表明Sesn2抑制神经元I/R期间的氧化应激损伤。然而,Sesn2是否作为内源性抗氧化剂参与维持心肌I/R期间的氧化还原稳态目前尚无报道,具体机制也不得而知。研究目的:(1)明确Sesn2是否作为内源性抗氧化剂减轻心肌I/R损伤,改善心脏I/R期间的收缩功能;(2)探讨Sesn2能否减轻心肌I/R期间氧化应激相关的内质网应激和炎症反应,抑制氧化应激相关级联信号的激活。研究方法:WT小鼠和Sesn2 KO小鼠随机分配到手术组和假手术组;以在小鼠心肌I/R损伤中有明显保护作用,但在临床转化中效果并不满意的公认的外源性抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)为阳性对照,各组小鼠进一步随机分为以下六组:WT、WT+NAC、Sesn2 KO、Sesn2 KO+腺相关病毒9(AAV9)-Sesn2、Sesn2 KO+NAC和Sesn2 KO+AAV9-Sesn2+NAC。小鼠缺血45分钟后再灌注24小时,构建体内心肌I/R模型;或在Langendorff系统中进行25分钟的整体缺血和30分钟的再灌注,构建离体心肌I/R模型,以测量心肌梗死面积和心脏功能,分析相关蛋白质表达的变化。分离各组小鼠的原代心肌细胞,缺氧20分钟后复氧1小时,构建细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型,以测定心肌细胞收缩力、Ca2+信号、线粒体超氧化物以及氧化应激相关信号通路的变化。研究结果:无论在体内或离体心脏I/R后,Sesn2 KO组的心肌梗死面积和心功能损害明显大于WT组心脏,AAV9介导的Sesn2转染能恢复Sesn2 KO小鼠心脏中Sesn2的蛋白水平,并显著减轻I/R后Sesn2 KO小鼠的心肌损伤和心功能损害,改善H/R应激期间心肌细胞的收缩功能和对Ca2+的处理能力,这些变化可能是由于Sesn2作为内源性抗氧化剂抑制了H/R期间超氧化物的产生,减轻了氧化应激损伤。无论Sesn2表达情况如何,NAC处理都能显著减轻I/R(或H/R)导致的心肌损伤和心功能损害,而AAV9-Sesn2和NAC的合用并不能进一步减轻心肌I/R或(H/R)损伤。同时,Sesn2缺失加剧了I/R(或H/R)期间内质网应激相关蛋白GRP78、ATF4和CHOP的上调,促进了炎症介质COX-2、IL-6和TNF-α的表达,以及MAPK信号通路的过度激活。恢复心肌细胞中的Sesn2表达或NAC预处理都能改善Sesn2缺乏的心脏(或心肌细胞)中I/R(或H/R)导致的这些变化,而AAV9-Sesn2和NAC的合用并不能较NAC单独处理进一步减轻I/R或(H/R)所致的内质网应激、炎症反应和MAPK通路激活。结论:(1)Sesn2作为一种内源性抗氧化剂,能够显著减轻心肌I/R导致的氧化应激损伤,改善I/R期间的心脏收缩功能;(2)Sesn2抑制心肌I/R期间氧化应激相关的内质网应激和炎症反应;(3)Sesn2作为一种内源性适应性反应,在心肌I/R期间抑制氧化还原敏感的MAPK级联信号的激活。