【摘 要】
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目的观察氟非尼酮（AKF-PD）对巨噬细胞NLRP3炎性体的影响,并进一步探讨AKF-PD在巨噬细胞中抑制NLRP3炎性体的潜在作用机制。方法选取健康BALB/c小鼠,分离提取腹腔原代巨噬细胞。将得到的原代巨噬细胞随机分为正常组、模型组、AKF-PD给药组。正常组:采用RPMI1640培养基培养;模型组:加入脂多糖（LPS）（500 ng/ml）3小时,三磷酸腺苷（ATP）（5m M）共同诱导30
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目的观察氟非尼酮（AKF-PD）对巨噬细胞NLRP3炎性体的影响,并进一步探讨AKF-PD在巨噬细胞中抑制NLRP3炎性体的潜在作用机制。方法选取健康BALB/c小鼠,分离提取腹腔原代巨噬细胞。将得到的原代巨噬细胞随机分为正常组、模型组、AKF-PD给药组。正常组:采用RPMI1640培养基培养;模型组:加入脂多糖（LPS）（500 ng/ml）3小时,三磷酸腺苷（ATP）（5m M）共同诱导30分钟或使用鱼藤酮（10 u M）刺激12小时建立模型;AKF-PD给药组:提前24小时给予AKF-PD（2 m M）处理巨噬细胞,再加入LPS+ATP或鱼藤酮共同诱导。采用流式细胞术检测线粒体活性氧的释放;深红色线粒体荧光探针（Mito Tracker Deep Red）观察线粒体平均荧光强度;透射电镜观察巨噬细胞自噬小体的数量;Western-blot检测细胞上清中的Caspase-1和IL-1β的表达,线粒体相关蛋白VDAC,MAVS以及通路及自噬相关蛋白PI3K/AKT/m TOR、LC3、Beclin-1的变化。结果1、Western blot法检测AKF-PD对激活的巨噬细胞IL-1β、Caspase-1表达的影响。与正常组相比,模型组IL-1β、Caspase-1的表达均明显增高（P＜0.05）,予以AKF-PD后,IL-1β、Caspase-1的表达均有所降低（P＜0.05）。2、AKF-PD对巨噬细胞线粒体的影响。与正常组相比,模型组线粒体活性氧释放增加（P＜0.05）,予以AKF-PD后,线粒体活性氧释放减少（P＜0.05）;另外,共聚焦镜下观察到给药组线粒体Mito Tracker Deep Red强度减弱（P＜0.05）,表明了线粒体损伤程度减轻;Western blot实验证明,LPS+ATP模型组VDAC、MAVS蛋白的表达显著高于正常组（P＜0.05）,予以AKF-PD后VDAC、MAVS的表达均有所降低（P＜0.05）。3、AKF-PD对巨噬细胞自噬的影响。与LPS+ATP模型组比较,AKF-PD组的磷酸化PI3K/AKT/m TOR蛋白表达减少,而Beclin-1、LC3II表达增高（P＜0.05）;与LPS+ATP模型组相比,透射电镜下的AKF-PD组自噬小体的数量增加。结论1、AKF-PD可以减轻小鼠腹腔原代巨噬细胞线粒体的损伤。2、AKF-PD可以促进小鼠腹腔原代巨噬细胞的自噬。3、AKF-PD可能通过调控自噬和维持线粒体稳态,抑制巨噬细胞NLRP3炎性体的活化。
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