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研究背景及意义:甲型流感病毒（influenza A virus,IAV）不仅能引起流感季节性流行,更能引发流感世界大流行,给人类带来了沉重的健康和经济负担。最近几年,中国多次出现禽流感病毒感染人并致死的事件,在一些国家,还出现了猪流感病毒感染人的事件,禽源性和猪源性IAV持续威胁着人类的健康,对不同种属来源的IAV感染人体的分子机制进行研究显得非常必要,而miRNA研究的兴起,为IAV感染机制的揭示提供了一个新思路。虽然目前大量研究证明,有一些miRNA参与了流感病毒的感染,但大多针对某一亚型的IAV进行研究,对多种属来源的IAV感染均具有调控作用的miRNA研究非常少,而这些miRNA可能在IAV感染过程中发挥着重要作用,并有潜力成为广谱抗流感药物或疫苗研究的新靶标。本课题通过将三种不同种属来源的IAV在体外感染哺乳动物细胞、体内感染小鼠,对其感染能力进行研究,并对IAV感染后的A549细胞差异表达的miRNA进行筛选和功能验证,来探究不同种属来源的IAV的感染特征,揭示miRNA在甲型流感病毒感染人体过程中所发挥的调控作用,为甲型流感病毒感染哺乳动物的机制阐明提供理论依据,也为miRNA应用于抗流感药物和疫苗研发奠定基础。目的:1.揭示三种不同种属来源的IAV对哺乳动物及细胞的感染特征。2.筛选在三种不同种属来源的IAV感染中起共同调控作用的miRNA。3.初步验证hsa-miR-371a-5p对两个靶基因是否有调控功能,并探索此miRNA对三种病毒感染产生的影响。方法:1.选用三种不同种属来源的 IAV:人季节性流感病毒H3N2（HumanBr07）、猪源性流感病毒H1N1（SW3861）和禽源性流感病毒H3N2（AVI9990）,分别感染哺乳动物细胞及小鼠,摸索最佳感染条件,建立细胞感染模型和动物感染模型,并使用HA、TCID50、空斑形成试验、免疫荧光试验、免疫组化试验等技术来研究三种病毒的致病性特征,有助于阐明不同宿主来源的IAV的致病机制。2.将三种不同种属来源的IAV感染A549细胞,使用miRNA芯片检测、高通量测序、生物信息学方法,对宿主细胞的miRNA和mRNA表达谱进行整合分析,获得miRNA-mRNA相互作用关系对,来筛选在三种IAV感染中具有共同表达模式的miRNA,并分析预测出这些miRNA在IAV感染过程中的调控通路。此外,还使qPCR来验证了 8个miRNA和13个mRNA在感染细胞中的实际表达情况。3.使用iTRAQ技术获取三种不同种属来源IAV感染A549细胞后的蛋白质表达谱,还对这些蛋白质进行GO和KEGG功能富集分析,PPI分析,并结合miRNA表达谱,得到与IAV感染相关的miRNA-蛋白质关系对。另外,还使用了 qPCR和Western blot法来验证了 4个miRNA和3个蛋白质在染毒A549细胞中的实际表达情况。4.选择hsa-miR-371a-5p及其两个潜在靶基因（IFIT2和XAF1）进行功能验证,使用 hsa-miR-371a-5p inhibitor/mimics 转染 A549 细胞,模拟hsa-miR-371a-5p的去表达/过表达,并用qPCR和Western blot技术来检测hsa-miR-371a-5p和靶蛋白的表达量,以探索hsa-miR-371a-5p与两个靶基因的相互作用关系,此外,还使用hsa-miR-371a-5p mimics来模拟A549细胞中hsa-miR-371a-5p过表达,逆转因IAV感染引发的A549细胞hsa-miR-371a-5p表达下调的情况,研究hsa-miR-371a-5p过表达后对病毒感染产生的影响。结果:1.三种病毒感染细胞的CPE无差异;三种病毒在MDCK细胞中HA效价均高于A549细胞,但低于初始HA效价（鸡胚扩增后测定）;三种不同种属来源的流感病毒在两株细胞中的TCID50存在差异:在A549细胞中,SW3861>HumanBr07>AVI9990,而在 MDCK 细胞中,感染初中期（0-48h）HumanBr07 的 TCID50高于 SW3861,但在感染晚期（48～72h）,SW3861的TCID50高于HumanBr07,三种病毒在A549细胞中增殖的稳定性最好,易重复,A549细胞更适于用来作为流感病毒致病性研究的细胞模型;三种流感病毒都能感染BALB/c小鼠,但不会导致小鼠死亡,其中SW3861的感染率最高,HumanBr07和AVI9990感染率无差异。2.与未感染组相比,在三个感染组中,存在20种miRNA和1286种的mRNA差异表达,且其表达趋势一致,得到了 1852种miRNA-mRNA相互作用关系对;通过GO和KEGG分析,发现有107对miRNA-mRNA与病毒防御相关、79对miRNA-mRNA参与甲型流感病毒相关通路;此外,挑选了 8种miRNA和13种mRNA进行qPCR验证,发现其表达情况与测序结果一致。3.有142种蛋白质在三种IAV感染的A549细胞中均差异表达且其表达趋势相同,并得到了 455对miRNA-蛋白质相互作用关系对;差异蛋白功能分析发现,有30个KEGG条目与流感病毒感染相关,此外,挑选了4种miRNA和3个蛋白质进行初步验证,发现其表达情况与测序结果一致。4.hsa-miR-371a-5p能够同时影响两个靶蛋白（IFIT2和XAF1）的表达:hsa-miR-371a-5p表达量下调后,IFIT2和XAF1均出现了差异上调,而对hsa-miR-371a-5p进行过表达后,IFIT2和XAF1均出现了差异下调;hsa-miR-371a-5p表达量上调后,三个病毒感染A549细胞的HA效价均上升、M基因表达量均上调,但病毒的TCID50未发生变化。结论:本研究以三种不同种属来源的IAV作为研究对象,围绕三种病毒的感染能力和感染相关miRNA的作用机制开展研究。初步得到以下发现:1.三种不同种属来源的IAV感染A549细胞和BALB/c小鼠后,AVI9990在感染初期生物合成能力最强,但适应能力最弱,毒力最弱;SW3861适应能力良好,毒力最高;HumanBr07适应力最好,毒力中等。2.有 1852对miRNA-mRNA可能与 IAV感染相关,107对miRNA-mRNA与病毒防御相关、79对miRNA-mRNA参与甲型流感病毒相关通路。3.有455对miRNA-蛋白质可能与IAV感染相关,352对蛋白质之间存在相互作用关系。4.在A549细胞中,hsa-miR-371a-5p的表达量改变能同时引起两个潜在靶蛋白（IFIT2和XAF1）的表达量发生负向变化;hsa-miR-371a-5p表达量上调,能够促进三种流感病毒复制。综上所述,miRNA在IAV感染过程中发挥着重要的调控作用,本研究将miRNA分别与mRNA、蛋白质进行交联分析,筛选出了与三种不同种属来源的IAV感染相关的miRNA,还发现了 hsa-miR-371a-5p能够作用于两种靶蛋白,并促进IAV复制,这些结果提示利用miRNA进行抗流感靶点研究的潜在价值。