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肺癌是严重危害人类健康及影响人们生活质量的重大疾病之一,在全世界范围内其发病率和死亡率占人类常见肿瘤的第三位。2015年预计有超过22万新增病例被诊断为肺癌,而且同年死于肺癌的患者将超过15.8万。目前临床上肺癌常见的治疗方法,包括外科手术切除治疗,放射线治疗,化疗等并不能减少肺癌的发生率,肺癌患者的5年生存率并不高,因此我们迫切需要寻求新的治疗方法。近年来,免疫治疗作为癌症治疗的新方法,引起了研究者极大的兴趣。癌症靶向免疫疗法,例如免疫检查点抑制剂,已经演化成第四种肺癌治疗的策略,给癌症患者带来了新的希望。在肿瘤免疫细胞治疗中,T细胞具有将肿瘤抗原作为外来物识别的能力并且能够快速清除它们,尽管存在细胞毒性T细胞识别肿瘤相关抗原,肿瘤细胞也常常逃脱或逃避免疫系统的攻击。机体产生的免疫反应与一系列共刺激分子及共抑制分子紧密相关,免疫检查点是肿瘤细胞逃脱或逃避免疫系统攻击的一种主要方式。目前已经发现的抑制性免疫检查点有细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、淋巴细胞激活基因3(LAG-3)以及PD-1的两个主要配体PD-L1和PD-L2等,它们能够导致效应T淋巴细胞的耗竭和减少,减弱机体免疫系统产生的抗肿瘤反应。随着人们对免疫检查点和抗肿瘤免疫反应理解及认识的加深,生产免疫检查点阻断单抗是修复免疫系统和恢复T细胞抗肿瘤免疫反应的有效方式。临床实验发现靶向程序性细胞死亡蛋白1或其配体PD-L1的单抗对大多数肿瘤都有临床反应,包括恶性黑色素瘤、肺癌、卵巢癌等。尽管抗PD-1抗体阻断治疗对恶性黑色素瘤或非小细胞肺癌患者有很好的疗效,但是其较高的生产成本和药物不良反应限制了它在临床中的运用。本文构建并检测了靶向EGFR家族成员并且高水平稳定表达PD-1抗体的Herin CAR-T细胞对几种肺癌细胞株的体外及体内杀伤作用。(1)构建包含PD-1单链抗体可变区的重组质粒,通过piggy Bac转座子系统转染T细胞,获得能够高水平稳定表达PD-1抗体(5-10ug/ml)的T细胞(PIK-PD1),同时Western blotting实验证明T细胞分泌的PD-1抗体包含正确的重链(50Kd)。(2)检测PIK-PD1细胞分泌的PD-1抗体的功能,包括封闭活化T细胞表面表达的共抑制分子PD-1、Tim3以及LAG3,促进T细胞的增殖。通过流式检测发现表达PD-1抗体的PIK-PD1细胞相比未电转的对照T细胞而言能够增强CD107?,记忆标志CD62L、CD45RO、CCR7的表达。(3)构建表达PD-1抗体的Herin CAR-T细胞(PD1-Herin CAR-T),通过检测其与肿瘤细胞共培养后细胞因子的分泌,发现IL-2、IL-4、IL-6、TNF-?和IFN-?的分泌量相比对照的Herin CAR-T细胞而言明显要高。同时我们发现PD1-Herin CAR-T细胞能够更有效的杀伤肺癌细胞株NCI-H1299,NCI-H460,NCI-H23和H446。(4)NCI-H460小鼠移植瘤模型中,分泌PD-1抗体的CAR-T细胞治疗组相比PBS和Control T细胞治疗组能够更有效地抑制肿瘤的生长,且PD1-Herin CAR-T细胞在小鼠体内能更好地增殖。本文首先构建了能够高水平稳定表达PD-1抗体的T细胞,并且发现T细胞分泌的PD-1抗体能够促进T细胞的增殖,细胞因子的分泌,封闭活化T细胞表面PD-1、LAG3、Tim3等抑制性免疫检查点的表达。同时也构建了表达PD-1抗体的Herin CAR-T细胞,发现PD1-Herin CAR-T细胞在体外和体内实验中能够更有效的杀伤肺癌细胞株。