利什曼病是WHO/TDR列出的对人类危害严重的六类热带病之一。利什曼原虫属包含很多不同的种和亚种，其分类相当复杂。在世界范围内，利什曼原虫不同的种及亚种可引起不同类型的利什曼病，它们具有不同的流行病学特征。利什曼原虫种株的分析和鉴定对于提高临床疗效、控制此病的流行有重要意义。在我国，主要流行的是由杜氏利什曼原虫(Leishmaniadonovani，L.d.)导致的内脏利什曼病，即黑热病。该病对人体危害严重，是威胁患者生命的人兽共患病。我国的内脏利什曼病流行区根据地理分布和传染源不同分为荒漠型(野生动物源型)、山丘型(犬源型)和平原型(人源型)，不同疫区的内脏利什曼病在患者发病年龄、治疗效果、是否易复发和有无保虫宿主等方面有着明显的差异，但病原体形态难以区别。传统的种株分析方法主要依据地理位置、临床表现、流行病学特征、原虫形态等外在特征进行分类，这对确定我国不同疫区利什曼原虫种株之间的关系往往不够。在现代分类研究中，分子生物学技术的运用越来越多。多年以来，为从分子水平揭示我国不同疫区利什曼原虫种株间的差异，从而为黑热病的防治提供科学依据，在该领域进行了许多极有意义的研究，如对利什曼原虫kDNA、nDNA的研究，用kDNAPCR-SSCP、RAPD分析等多种方法对我国不同疫区利什曼原虫分离株进行它们之间同源性的分析及种株鉴定。但由于其复杂性，出现了一些不一致的结论。因此我们有必要进一步深入研究，从基因水平上进一步揭示我国不同疫区杜氏利什曼原虫分离株之间的关系，从而在根本上为我国黑热病的防治提供科学依据。 核糖体存在于所有的原核生物和真核生物细胞内，主要功能是作为细胞中蛋白质合成场所。利什曼原虫编码核糖体的基因rDNA基因位于单一的染色体上，头尾相接，呈串珠状，拷贝数为160个重复单位。每个重复单位均可编码18SRNA、5.8SRNA和28SRNA，编码rRNA基因长度为8kb，而重复单位之间为非转录的基因间隔区(NTS)，长度平均为8.5kb。rDNA基因内转录基因间隔区(ITS)平均长度为1kb。由于rDNA基因的高度保守性使其突变累积在成串重复排列的rRNA基因之间和两侧的间隔区序列中，而使核糖体基因间隔区序列具有种内和种间、以及亚种和株的特异性，从而应用于分类学和种株鉴定，ITS的序列分析在植物、动物、真菌、原虫等系统进化和分类学研究中已被广泛应用。 本研究用PCR方法扩增我国荒漠、山丘及平原疫区杜氏利什曼原虫分离株L.d.XJ771，L.dSC10及L.d.SD2的ITS片段(包含5.8SRNA基因及其两侧的ITS1和ITS2片段)，分别将其克隆入pMD18-Tvector，进行序列测定及分析。首次报道了我国荒漠、山丘和平原疫区杜氏利什曼原虫分离株的ITS序列及三者之间的差异。研究结果显示：5.8SRNA基因不论是这三个疫区分离株之间，还是与Genebank内其他利什曼原虫分离株之间，其核苷酸序列一致性均达到99％以上，充分显示了rRNA基因的保守性。而ITS1及ITS2片段则在各分离株之间存在较大的差异性，也充分显示了我国三个疫区分离株之间及与国外利什曼原虫分离株之间同源程度的差异。其中Ld.SC10与L.d.SD2均缺失L.dXJ771的ITS2片段第459～536位共计78个核苷酸序列，系国内外首次报道。 根据我国3个疫区利什曼原虫分离株的ITS序列的差异，可推导出荒漠分离株、山丘分离株与平原分离株之间存在同源性的差异，各自都有其较独特的ITS核苷酸序列区域。且3个疫区利什曼原虫分离株的ITS序列在同源程度上也存在明显差异。荒漠分离株与平原分离株及山丘分离株距离较远，与之相比较，平原分离株与山丘分离株之间的距离相对略近一些，荒漠分离株与山丘分离株的同源性略高于荒漠分离株与平原分离株的同源性。 通过对ITS片段序列的分析，从基因水平进一步说明了我国荒漠疫区、山丘疫区、平原疫区利什曼原虫分离株之间存在的差异。这从一定程度上解释了三个疫区黑热病在临床症状、药物治疗、流行病学等方面存在的不同，进一步揭示不同分离株之间的关系，从而为我国不同疫区黑热病的防治提供了科学依据。 嗜肺军团菌(Legionellapneumophila,L.p.)是除新型冠状病毒外引起非典型肺炎的关键致病菌之一。军团菌是兼性胞内寄生菌，普遍存在于天然水，人工水环境或土壤中，能侵入人类肺泡巨噬细胞及其它巨噬细胞、肺泡上皮细胞和水生环境中的原虫中并寄生。军团菌对外环境的抵抗力很强，在空调系统冷却塔水、淋浴头水、井水以及自来水等人类生活用水领域广泛存在。随着空调、加湿器等设备在现代生活中的普及，军团菌传播和感染、流行的机会也日益增加。 人类主要通过吸入含有嗜肺军团菌的气溶胶而感染，老年人和幼儿易感染发病，长期吸烟是本病发病的诱因，免疫力低下者和使用免疫抑制剂者易发生军团菌感染。军团菌也是医院内感染的重要病原体之一。关于军团菌感染的致病机制尚不十分清楚。临床表现有两种类型：军团病和庞提亚克热。我国已将军团病列为需要重点预防的一种新发传染病。军团病的预防已成为我们面临的重大课题，但目前尚缺乏理想的方法，因此，研制出安全、有效的疫苗对于军团菌病的防治具有十分重要的现实意义。 研究表明，用多种单价疫苗联合免疫有可能带来比单价疫苗免疫更为广泛有效的免疫应答，且核酸疫苗便于实现这种联合免疫。嗜肺军团菌肽聚糖关联的脂蛋白(peptidoglycan-associatedlipoprotein，PAL)与热休克蛋白60(Heatshockprotein60，HSP60)均已被证明为良好的免疫保护性抗原。在本研究中，我们以嗜肺军团菌L.p.1基因组DNA为模板，采用PCR技术扩增嗜肺军团菌PAL基因，将该基因定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中，成功构建真核表达重组质粒，在国内首次报道了嗜肺军团菌L1型的PAL基因的核苷酸序列。本文扩增的嗜肺军团菌L1型PAL基因片段长度为531bp(含起始密码子和终止密码子)，其推导出的氨基酸序列含176个氨基酸残基。与其他GeneBank内已报道嗜肺军团菌PAL基因核苷酸序列的一致性均在98％以上，其推导的氨基酸序列一致性和阳性率均在95％以上。将构建好的真核表达重组质粒pcDNA3.1-PAL和本研究室已构建的重组质粒pcDNA3.1-HSP60分别转染NIH3T3细胞，并设pcDNA3.1-PAL与pcDNA3.1-HSP60混合共转染组，经免疫荧光和RT-PCR检测，重组质粒pcDNA3.1-PAL、pcDNA3.1-HSP60和pcDNA3.1-PAL+pcDNA3.1-HSP60混合转染NIH3T3细胞后均获得了有效表达，为嗜肺军团菌核酸疫苗的进一步研究奠定了基础。