冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease, CHD)是世界范围内影响人们身心健康的社会及公共卫生问题之一。在西方国家,冠心病是致死致残的首要原因；近年来,随着我国社会经济的快速发展,人们的生活水平以及寿命获得了极大的提高,工作方式和饮食习惯的发生了显著的变化,冠心病发病率和死亡率也呈现出年轻化、快速上升趋势,逐渐成为我国居民死因构成中上升最快及威胁公众健康最为严重的的疾病之一,严重加剧了我国社会公共卫生负担。降低冠心病的发病率和死亡率,已成为社会公共卫生领域迫切需要解决的重要问题之一。流行病学研究表明,积极干预AS及冠心病的相关危险因素有助于AS及CHD的早期防治。传统的危险因素包括年龄、性别、家族史、吸烟、高血压、代谢综合征、糖尿病与胰岛素抵抗、高脂血症、体力活动和肥胖等。这些危险因素可单独或相互促进AS和CHD的发生发展,在临床实践中已经获得了充分重视。然而我国冠心病的发病及死亡率仍呈逐渐升高趋势,并有向年轻化发展的势头。近年来,一系列新的危险因素,特别是炎症免疫相关的危险因素相继被发现。可见,目前尚无法做到全面严格的控制冠心病得危险因素。因此,对冠心病发病机制的深入研究是更有效防治冠心病的关键。近年来,免疫与炎症在动脉粥样硬化(atheroslerosis, AS)及冠心病发生发展中的作用逐渐被人们认识。目前普遍认为炎症反应是不稳定斑块形成与发展的核心因素,免疫机制参与了动脉粥样硬化及冠心病发生发展的全过程。甚至有些学者认为冠心病是一种慢性炎症与自身免疫性疾病。在急性冠脉综合征(acute coronary syndrome, ACS)患者外周血中也可以检测到活化的T淋巴细胞和抗原递呈细胞存在,IFN-γ、TNF-α和IL-6、IL-18、IL-12等细胞因子和炎症因子水平明显升高,ACS患者体内存在着免疫系统激活和炎症加剧；在AS斑块尤其是不稳定斑块中存在大量的免疫细胞,其中中性粒细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞以及树突状细胞(dendritic cells, DCs)是斑块内炎症细胞的主要组成部分。斑块内免疫细胞的积聚,并由此引发的斑块内炎症反应的增强,促使了不稳定斑块的形成。树突状细胞(dendritic cells, DCs)作为联系天然免疫与获得性免疫的关键,是己知体内功能最强的专职抗原提呈细胞。在抗原刺激后,DCs经历了由未成熟向成熟、外周非淋巴组织向次级淋巴器官迁移,最后激活初始T细胞,发挥特异性免疫应答。作为调控免疫炎症反应的关键细胞,DCs在AS的发生发展过程中扮演着重要角色。一方面,冠心病患者外周血DCs处于成熟活化状态,AS及冠心病的相关危险因素如尼古丁(烟草主要成分)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)、同型半胱氨酸、雄性激素、CRP等都可通过诱导DCs成熟,增强免疫应答,促进AS发生发展。另一方面,DCs的分布与AS的进展密切相关。在正常动脉、AS前期动脉以及AS病变处均有表达。DCs参与AS斑块形成与进展,并且随着AS斑块向易损斑块进展,DCs数量及免疫应答能力均增强。具有稳定斑块作用的他汀类调脂药物可减少斑块内DCs的数量以及DCs的成熟。可见,DCs在AS病变中聚集并介导免疫应答是AS形成与发展的重要因素之一目前,多数观点认为斑块内DCs积聚是在相关危险因素的作用下由外周血迁移入斑块内。本课题组及国外相关研究均表明CHD,特别是ACS患者外周血髓源性树突状细胞(myeloid DCs, mDCs)前体比例较正常对照明显降低。由于vDCs的含量有限,CHD患者白细胞亚群比例和数量,以及骨髓生成功能正常,不存在DCs生成减少或凋亡增加等因素,我们推测AS病变处聚集的DCs可能部分由外周血DCs迁移而来。临床与基础研究进一步证实冠心病患者体内存在促DCs迁移的相关条件。在冠心病患者外周血中多种粘附分子如P-选择素、E-选择素以及ICAM-1以及趋化因子如fractalkine、CCL19、CCL21等含量明显增加,冠心病的相关危险因素,如氧化低密度脂蛋白、糖基化白蛋白、尼古丁和热休克蛋白(heat shock protein, HSP)等都具有诱导DCs成熟以及高表达黏附分子和趋化因子受体的能力。在自发性AS动物模型中,基因沉默CCR7、CX3CR1可明显抑制DCs的迁移能力,减缓AS的进程以及AS病变部位DCs的含量。可见,抑制DCs迁移可明显延缓AS进展。对DCs迁移机制的深入研究,有助于AS及冠心病积极干预。MicroRNA,是一类长约21～25个核苷酸片段、内源性非编码RNA,通过介导基因转录后沉默来调控基因表达的。它在基因转录后水平上,通过与靶mRNA互补结合,可调控多个mRNA和蛋白的表达,协同发挥细胞调节功能,并且具有呈剂量依赖方式调控靶基因表达的特点。microRNA广泛参与细胞的生长、分化、增殖、凋亡,与心血管疾病以及DCs的抗原提呈功能密切相关。对于microRNA在树突状细胞迁移中的作用尚没有研究报道。为深入探讨在AS条件下DCs的迁移调控机制,本课题在前期研究基础上将从以下四个方面进行研究：分析外周血DCs亚群变化与冠心病患者主要危险因素的关系；利用基因芯片技术检测ox-LDL对单核细胞源性DC microRNA表达的影响；利用生物信息学方法筛选差异表达最显著的microRNA的靶基因,双荧光素酶报告基因技术进行验证；microRNA对未成熟DCs表型、迁移以及靶基因的表达的影响,并进一步验证该靶基因对DCs迁移功能的影响。通过上述研究可能会筛选出调控DCs迁移的相关microRNA及其调控机制。研究结果如下：1冠心病患者外周血DCs亚群比例变化与相关危险因素分析1.1研究对象一般临床资料各组在性别比例、年龄分布、冠心病危险因素如高血压、吸烟以及糖尿病等所占人群比例、服用药物、总胆固醇、甘油三酯、白细胞数、尿酸、肌酐水平等方面比较,无明显统计学差异(P>0.05)；在糖化血红蛋白、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-c)、心肌肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponinⅠ, cTnI)等方面比较,存在统计学差异(P<0.05)。1.2各组研究对象外周血树突状细胞亚群比例四组外周血mDC占外周血单核细胞比例间相比,差异具有统计学意义(P< 0.01), AMI组和UAP组的mDC占外周血单个核细胞比例明显低于对照组和SAP组(P<0.01)；四组间外周血pDC占外周血单核细胞比例相比,差异具有统计学意义(P=0.043)。1.3外周血浆相关因素含量以及冠脉Genisi评分变化外周血浆CCL2、ox-LDL、Fractalkine、CCL21、CCL19含量以及Genisi评分在四组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。其中,CCL2、ox-LDL、Fractalkine、CCL21、Genisi评分等指标分别在四组间相比,均存在统计学差异(P<0.05),由对照组、SAP组、UAP组、AMI组呈依次递增趋势。CCL19在AMI组、UAP组较对照组、SAP组明显升高(P<0.05)。1.4多元线性回归分析影响外周血mDCs比例的相关因素应用多元线性回归分析所有研究对象的已知因素,发现以下因素可能对外周血mDCs比例具有影响,分别为：ox-LDL、CCL21、CCL19、CCL2、Genisi评分、cTnI、进一步采用多元线性回归逐步分析提示ox-LDL、CCL2、Genisi评分以及pDCs比例可明显影响mDCs比例变化。1.5 ox-LDL、CCL21、CCL19、CCL2以及Genisi评分、cTnI与外周血mDCs比例的相关性分析通过对ox-LDL、CCL21、CCL19、CCL2与外周血mDCs比例的相关性分析发现,ox-LDL与外周血mDCs比例相关性最强(r=-0.710,P<0.001),其后依次是CCL2 (r=-0.626, P<0.001)、CCL21 (r=-0.449, P< 0.001)、CCL19(r=-0.242,P<0.002)。通过对Genisi评分与外周血mDCs比例的相关性分析表明Genisi评分与外周血mDCs比例呈明显负相关(r=-0.807,P<0.001)；对cTnI、pDCs比例与mDCs比例的相关分析显示cTnl与外周血mDCs比例无明显相关性(r=-0.125, P=0.111),pDCs比例与]mDCs比例无明显相关性(r=0.238,P=0.092)。1.6 ox-LDL、CCL21、CCL19、CCL2与Genisi评分的相关性分析通过对ox-LDL、CCL21、CCL19、CCL2与评价冠状动脉粥样硬化总负荷金标准Genisi积分的相关性分析发现,ox-LDL与Genisi积分相关性最强(r=0.684,P<0.001),其次是CCL2 (r= 0.608, P< 0.001);由于CCR7是CCL21、CCL19的共同受体,偏相关分析显示CCL21与Genisi积分存在相关性(r=0.317, P< 0.001)、pDCs比例与Genisi积分无明显相关性(r=0.011,P=0.891)。2 ox-LDL对人单核细胞源性DCs microRNA表达的影响2.1 ox-LDL可促进人外周血单核细胞源性DCs成熟2.1.1 DCs培养的形态学观察培养5天后部分细胞贴壁,部分细胞悬浮,呈圆形或类圆形,周边呈毛刺状或棘状突起；给予ox-LDL刺激48h后,呈悬浮生长,分布较均匀,大小为成熟单核细胞的1-2倍,具有典型的树枝状突起,数量不等,形态不一；对照组细胞多数悬浮生长,部分聚集成簇,呈类圆形,有毛刺状突起。2.1.2 ox-LDL对DCs表型、IL-12分泌及DCs迁移能力的影响流式细胞术检测发现ox-LDL组DCs表面CD1α、CD83、CD86分子表达明显上调,与对照组相比,存在显著性差异(P<0.01); ox-LDL组DCs培养上清液中IL-12浓度明显增加,与对照组相比,存在显著性差异(P<0.01)。ox-LDL组DCs迁移至下室数量明显增加,与对照组相比,存在统计学差异(P<0.01)。2.2 ox-LDL对DCs microRNA表达的影响通过microRNA基因芯片检测分析,与对照组相比,ox-LDL组DCs有3基因上调表达>2倍,依次是miR-34a、miR-125a-5p、miR-155;4个基因下调表达>2倍,依次是miR-31、miR-1301、miR-212、miR-423-5p。同时对Spike Controls、Hybridization Controls等阳性对照信号检测表明芯片探针标记和杂交效率正常。2.3荧光定量PCR验证microRNA芯片检测结果分别对对照组与ox-LDL组两组样品进行检测。从扩增剂溶解曲线、电泳图结果可以看出miRNA RealTime PCR反应特异性都很好。Ox-LDL组miR-155和miR-31分别较对照组升高1.72倍、降低5.75倍。2.4 miR-34a在ox-LDL诱导的DCs中上调表达,并且与DCs迁移相关与对照组相比,]miR-34aΔCt在ox-LDL组明显降低,存在统计学差异(P<0.05),表明DCs内miR-34a表达明显上调；DCs中miR-34aΔCt的表达与其迁移呈负相关(r=-0.851,P<0.001),提示DCs miR-34a的表达上调与其迁移能力增强相关。3双荧光素酶报告基因系统验证miR-34a与SRC基因的调控关系3.1靶基因预测软件分析结果我们利用相关靶基因预测软件分析表明SRC可能是miR-34a的潜在靶基因,预测结果如下：miRanda、Targetscan、CircuitsDB均能预测成功。3.2 Rellina luciferase/Luciferase (RLUC/LUC)在各组细胞间的变化四组间RLUC/LUC相比,存在显著性差异(F=8.726,P=0.007)；其中与其它三组相比,pcDNA3.1(+)-miR-C2组RLUC/LUC最高(P<0.01). RLUC/LUC在pcDNA3.1(+)-hsa-miR-34a、psicheck2-SRC-3’UTR、psicheck2-SRC-MUT-3’UTR组间变化不明显,无明显差异(P>0.05)。但在pcDNA3.1(+)-hsa- miR-34a组的RLUC/LUC平均值仅比pcDNA3.1(+)-miR-C2组下降10.18%。3.3 miR-34a对DCs SRC表达的影响Western blotting检测DCs中SRC的表达,结果表明SRC在miR-34a过表达组及ox-LDL刺激组明显上调表达。4 miR-34a通过上调SRC表达促进DCs迁移4.1 miR-34a及SRC对DCs迁移功能的影响迁移细胞数在四组间相比,有显著性差异；与其它三组相比,miR-34a组最多(P<0.001)；PP2抑制剂组最少(P<0.05); miR-34a+PP2抑制剂组的迁移细胞数较对照组多(P=0.001)。以上结果提示SRC抑制剂PP2可减少DCs的迁移,但不能完全抑制miR-34a诱导的DCs迁移。4.2 miR-34a及PP2对DCs SRC及E-cadherin蛋白表达的影响Western blotting检测显示抑制DCs SRC可上调E-cadherin的表达,miR-34a可上调SRC表达以及抑制E-cadherin表达,提示miR-34a通过上调SRC表达进而抑制E-cadherin的表达。4.3 miR-34a及PP2对DCs表型CD86表达以及IL-12分泌的影响各组DC表型CD86以及IL-12分泌量相比,均存在显著性差异(P<0.001)。其中,在对照组与PP2抑制剂组的DCs CD86的表达分别较PP2抑制剂+miR-34a组及miR-34a组低(均P<0.001); miR-34a组IL-12分泌最多(P<0.001),其余三组间无明显差别(P>0.05)。通过上述四个部分的实验,我们能够得出以下结论：(1)冠心病患者外周血mDCs比例均下降,AMI患者外周血pDCs下降；其中,外周血mDCs比例与ox-LDL、CCL2、Genisi评分以及pDCs等因素密切相关。ox-LDL与nDCs比例以及Genisi评分关系最为明显。(2) ox-LDL可促使DCs中3个microRNA表达上调：依次是miR-34a、miR-125a-5p、miR-155; 4个microRNA表达下调：依次是miR-31、miR-1301、miR-212、miR-423-5p。其中1niR-34a上调表达最明显,与ox-LDL诱导DCs迁移呈正相关。(3) miR-34a通过上调SRC表达促进了DCs迁移。