布鲁氏菌病(简称“布病”)是由布鲁氏菌侵入机体引起人畜发病的乙类传染病,动物感染后表现为雌性流产、雄性睾丸炎等,人类主要通过接触患病动物及动物制品感染布鲁氏菌,感染后主要表现为间歇性发烧、多汗、关节疼痛、睾丸炎等症状,使劳动能力不同程度的减弱。为布鲁氏菌疫苗的研制提供理论基础,本研究从布鲁氏菌病患者全血中分离布鲁氏菌并以该菌为模板,克隆Omp10蛋白基因,构建原核表达载体和真核表达载体,来研究Omp10蛋白的相关功能;同时以该菌为模板,通过CRISPR-Cas9方法和同源重组方法构建羊种布鲁氏菌的VirB8基因缺失株,来研究VirB8基因的缺失对布鲁氏菌的影响。实验结果表明:1、通过血清学、病原学及分子生物学实验,在布鲁氏菌病患者全血中分离出了布鲁氏菌并鉴定该菌为羊种3型。2、以分离的羊种3型布鲁氏菌为模板,克隆Omp10蛋白基因,构建原核表达载体(Omps-pET28a)和真核表达载体(PCDNA3.1-Omp10),通过免疫荧光实验、淋巴细胞增殖实验、CCK8实验、流式细胞术等实验证明了Omp10蛋白同时具备抗原性和免疫原性。3、运用pBBR1MCS-5质粒和PwtCas9-Bacteria质粒,以及人工合成的trc启动子和sgRNAScaffold片段,通过酶切和酶连技术,构建可以在布鲁氏菌中表达Cas9蛋白的pCas9-PBBR1-sgRNA工作质粒。4、构建同源重组质粒T19-VirB8-LR,将pCas9-PBBR1-sgRNA工作质粒和同源重组质粒共同转化至布鲁氏菌感受态细胞中。筛选阳性菌落,进行PCR鉴定,结果未得到VirB8基因缺失株。CRISPR-Cas9系统在布鲁氏菌基因编辑中的应用有待进一步研究。