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猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)属于细小病毒科、细小病毒属成员,是引起母猪繁殖障碍性疾病的主要病原之一。PPV一般在猪源性生长分裂旺盛的细胞中进行增殖,感染PPV的细胞会产生明显的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)。细胞自噬作为细胞中维持稳态的重要方式,在病毒致病过程中发挥了重要作用。虽然关于细胞自噬与病毒间的相互作用机制研究已有很多报道,但细胞自噬如何调控PPV的复制,至今尚不清楚。本研究以PK-15细胞作为模式细胞,用PPV感染PK-15细胞和GFP-LC3质粒转染的PK-15细胞,western blotting检测细胞自噬相关蛋白的表达变化,在荧光显微镜下观测自噬体的形成。以PPV感染PK-15细胞、利用自噬诱导剂建立的PK-15细胞自噬模型、利用siRNA技术干扰自噬关键基因atg5的PK-15细胞,western blotting检测细胞自噬相关蛋白的表达、PPV VP2的表达,Real-time Q-PCR检测PPV的拷贝数和PPV VP2的mRNA水平。研究取得以下结果。1.以0 MOI、0.25 MOI、0.50 MOI、0.75 MOI、1.0 MOI、1.25 MOI PPV感染PK-15细胞24 h,western blotting检测发现,细胞自噬相关蛋白LC3-II随MOI增大而表达量升高,p62无明显降低;以1.0 MOI的PPV感染PK-15细胞0 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h,western blotting检测发现,LC3-II和p62的表达量在感染12 h开始上升,并随感染时间的延长而不断上升。利用GFP-LC3质粒转染PK-15细胞12 h后,再以0 MOI、0.75 MOI、1.0 MOI、1.25 MOI PPV感染转染后的PK-15细胞,同时,以1.0 MOI的PPV感染转染后的PK-15细胞0 h、12 h、24 h、36 h。荧光显微镜下观察发现,病毒梯度组中,自噬体在感染0.75 MOI后开始出现,且随MOI增大而增多。时间梯度组中,自噬体出现于PPV感染12 h后,且随时间的延长而增多。2.EBSS处理PK-15细胞4 h构建细胞自噬模型,western blotting检测显示,经EBSS诱导后的PK-15细胞中LC3-II表达量明显增加。然后,用1.0 MOI的PPV感染EBSS处理的细胞24 h后,western blotting检测显示,PPV VP2的表达量明显升高;提取PK-15细胞总DNA,Real-time Q-PCR检测到EBSS处理的细胞中的PPV拷贝数极显著高于对照组(P<0.01);提取PK-15细胞总RNA,反转录为cDNA后,Real-time Q-PCR检测到EBSS处理的细胞中PPV VP2 mRNA水平极显著高于对照组(P<0.01)。3.利用siATG5对PK-15细胞自噬关键基因atg5的特异位点进行干扰,阻断atg5基因的活性,western blotting结果显示,siATG5转染后抑制了atg5基因的表达。然后siATG5转染EBSS处理的细胞,western blotting结果显示,LC3-II表达量下降,p62表达量略有升高。1.0 MOI PPV感染PK-15细胞、siATG5转染的PK-15细胞、EBSS处理细胞24 h,western blotting检测结果显示,EBSS处理细胞PPV VP2升高,而siATG5转染的PK-15细胞的PPV VP2表达明显降低。提取PK-15细胞总DNA,Real-time Q-PCR检测结果显示,siATG5转染的PK-15细胞PPV拷贝数极显著低于对照组(P<0.01)。提取PK-15细胞总RNA,反转录为cDNA后,Real-time Q-PCR检测结果显示,siATG5转染的PK-15细胞PPV VP2 mRNA水平极显著低于对照组(P<0.01)。本研究发现了PPV感染可诱导PK-15细胞产生自噬,明确了细胞自噬促进PPV的复制。干扰自噬关键基因atg5后,细胞自噬被抑制,PPV的复制也受到显著抑制。该研究揭示了细胞自噬对PPV复制具有促进作用,证实了自噬基因atg5在细胞自噬促进PPV复制中发挥了关键作用。研究结果为进一步阐明PPV致病机制提供新的理论依据。