论文部分内容阅读
目的:通过体内和体外实验探讨积雪草酸(Asiatic acid,AA)对心肌缺血再灌注的保护作用及其机制方法:本文通过体外培养原代乳大鼠心肌细胞,结合厌氧袋与氧糖剥夺相结合(OGD)的方法模拟心肌细胞缺血-再灌住(I-R)损伤来观察AA对心肌细胞氧化损伤及心肌细胞凋亡的作用;体内通过结扎小鼠左前降支来建立I-R模型,观察AA对缺血再灌注损伤的心肌组织的保护作用,并探讨相关作用机制。具体方法如下:1.细胞模型的建立:原代培养乳鼠心肌细胞,采用氧糖剥夺及厌氧袋相结合法,利用DMEM(无糖)替代DMEM(高糖),厌氧袋模拟缺氧环境,缺氧6 h,再灌住12 h制备心肌细胞I-R模型。观察AA(20 umol/l)预处理对心肌细胞缺血再灌注损伤的作用。测定指标如下:荧光显微镜观察细胞内ROS荧光强度和心肌细胞线粒体膜电位,流式细胞仪检测细胞凋亡。Western Blot法检测心肌细胞MAPK信号激酶(p38,ERK1/2以及JNK)和线粒体凋亡相关蛋白(Caspase-9,Caspase-3,Cyto-chrome c,Bcl-2以及Bax)的表达。2.动物模型的建立C57B6雄性小鼠,术前AA或相应安慰剂预处理7天,加药组每天灌胃AA100mg/kg,后常规建立小鼠MI/R(30 min/6 h)模型。观察AA预处理对心肌缺血再灌注损伤的作用。测定指标如下:应用小动物彩色多普勒超声仪检测AA小鼠心脏血流动力学变化,解剖显微镜下拍照并用Image J面积测算软件计算心肌梗死面积,荧光显微镜观察组织ROS荧光强度,TUNEL原位标记法检测心肌组织中细胞凋亡,Western Blot法检测心肌细胞MAPK信号激酶(p38,ERK1/2以及JNK)和线粒体凋亡相关蛋白(Caspase-9,Caspase-3,Cyto-chrome c,Bcl-2以及Bax)的表达。结果:在体实验显示缺血再灌注后小鼠心脏功能降低、心肌梗死面积增大,AA预处理能够增加小鼠的LVEF和%FS水平,提高心脏功能,并能够降低心肌梗死面积,体外实验和体内实验的I-R模型均能够诱导心肌细胞凋亡,并且心肌细胞内ROS水平显著升高,线粒体膜电位显著降低,心肌细胞内Cleaved caspase-9,-3以及Cyto-chrome c蛋白表达显著增加,Bax/Bcl-2比例升高,p38、ERK1/2、JNK磷酸化水平增加。AA预处理可以显著降低心肌细胞凋亡率,降低心肌细胞内ROS水平,升高线粒体膜电位,降低Cleaved caspase-9,-3和Cyto-chrome c蛋白表达,降低Bax/Bcl-2比值,降低p38、ERK1/2、JNK磷酸化水平。结论:AA对心肌细胞I-R有保护作用,可抑制ROS诱导的心肌细胞凋亡,其机制可能与抑制线粒体凋亡通路的活化及阻滞MAPK信号激酶磷酸化有关。