霍乱弧菌是烈性传染病霍乱的病原菌,是革兰氏阴性菌,单鞭毛,具有游动性。霍乱弧菌通过口进入宿主体内,穿过胃,最后定殖在小肠上皮细胞表面,在此过程中,霍乱弧菌除了克服胃酸、宿主免疫等抵制外,还会受到来自肠道微生物菌群的抵制,称为定殖抗力。人类和哺乳动物肠道含有大量而且复杂的微生物菌群,其中99%是厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门的细菌和放线菌。不同的细菌通过调节自身代谢途径利用不同的营养物质进行生长,使得肠道内诸多细菌保持相对平衡的状态。肠道致病菌定殖时,竞争营养物质是其定殖的理论基础。本文挑选11个代谢相关基因利用乳鼠模型研究这些基因对霍乱弧菌定殖的影响,发现糖异生代谢途径基因ppsA和pckA对霍乱弧菌的定殖有重要的作用,因此锁定糖异生作用研究其对霍乱弧菌生理功能的影响,首先根据同源重组的原理对糖异生途径关键基因ppsA和pckA进行框内敲除得到单基因和双基因缺失株,在体外条件下,验证缺失株和野生型菌株的生长能力及对碳源的利用能力。结果发现,缺失株不能利用糖异生的底物以及TCA循环的中间产物进行生长,但是能正常利用糖酵解底物进行生长。双缺失株在LB液体培养基中有生长缺陷,并且主要是由于缺失株不能正常利用胰蛋白胨导致的。糖异生途径缺失后霍乱弧菌能正常利用粘液素中的单个糖类,但是对复杂物质粘液素的利用能力比WT弱10倍,并且在竞争条件下两者的差异扩大至100倍。本文利用启动子报告基因检测ppsA和pckA的表达量,发现糖异生作用的两条路径中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PckA是糖异生过程的关键酶。为了进一步研究糖异生作用对霍乱弧菌在小鼠体内定殖能力的影响,先后用乳鼠、成年鼠模型以及“M-E-A-T”模型进行研究。在小鼠实验中发现,糖异生途径缺失株△pckA和△ppsA/△pckA在肠道内的定殖能力明显弱于野生型菌株,随着天数的增加,△pckA与WT的差异从5倍逐渐扩大至500倍,△ppsA/△pckA与WT的差异从10倍逐渐扩大至1000倍,而△ppsA的定殖能力与野生型菌株之间无明显差异。说明在霍乱弧菌定殖过程中利用糖异生途径竞争肠道内的营养物质。由于肠道微生物菌群会影响肠道病原菌的定殖,因此为了研究肠道微生物土著菌群对霍乱弧菌定殖能力的影响,本文采用混合抗生素和链霉素处理小鼠,研究有无肠道微生物菌群的情况下糖异生缺失株与野生型菌株之间定殖能力的差异变化。发现存在较少肠道微生物菌时,糖异生途径缺失株与野生型菌株的定殖能力差异缩小了 10倍左右。说明肠道微生物菌群的存在使霍乱弧菌更多的利用糖异生途径来竞争营养物质进行定殖。此外,在生理性状方面,本文还研究了糖异生途径对霍乱弧菌游动性、生物膜的形成和毒力基因表达的影响,结果发现,糖异生作用影响霍乱弧菌的游动性,但并不影响生物膜形成能力和毒力基因表达能力。糖异生作用是细菌利用非糖含碳物质进行生长的重要途径,本文研究表明,糖异生途径不仅对霍乱弧菌在自然环境中生长有重要的影响,而且对霍乱弧菌在宿主肠道内定殖也起到重要的作用,说明霍乱弧菌利用糖异生作用进行定殖,肠道微生物菌群存在情况下,霍乱弧菌利用糖异生作用竞争营养物质,从而在宿主定殖时获得优势。可见糖异生作用对霍乱弧菌的生理功能有重要的影响,包括体外营养物质的利用、游动能力和体内定殖。