副溶血弧菌(Vibrio. parahaemolyticus)，又称嗜盐菌，广泛分布在海水、淤泥以及鱼虾贝类等水产动物体内，能引起虾红体病、鱼类皮肤溃烂等水产动物疾病，是水产养殖业的主要致病菌之一。人体食用被副溶血弧菌感染的水产动物，可引起急性肠胃病，若食物中副溶血弧菌含量超过106可引起败血症甚至死亡。据我国食源性疾病监测网数据显示，副溶血弧菌引起的食物中毒的规模与人群暴露范围已成为沿海省份微生物中毒的首要因素。目前副溶血弧菌的检测方法主要分为传统分离鉴定法与免疫学、核酸等现代检测方法。传统方法步骤繁琐，检测周期长，不能满足水产品致病菌快速检测的需要；现代检测方法在检测速度、灵敏性等方面有了很大提高，但是也存在样品前处理复杂、仪器化程度高、检测成本高等缺陷，尤其是不能实现目标病原体的特异性检测。建立一种快速、简便、灵敏、特异性强的检测方法有很重要的现实意义。本研究从筛选高效副溶血弧菌噬菌体出发，利用噬菌体的高度宿主专一性实现副溶血弧菌的特异性检测，结合细菌荧光素酶-FMN:NADH氧化还原酶体外发光体系实现副溶血弧菌的快速检测。主要研究内容如下：1以副溶血弧菌VP17802为宿主菌，采用双层琼脂平板法从污水样品中分离得到3株副溶血弧菌噬菌体VPp1、VPp2、VPp3，经液体增殖法与固体增殖法增殖后该噬菌体的效价较高，能达1010pfu/mL以上。双层琼脂平板37°C恒温培养12h后出现清晰透亮的噬菌斑。VPp1所形成的噬菌斑较小，边缘模糊，有大而明显的晕环，VPp2、VPp3所形成的噬菌斑中等大，边缘清晰，有较小或没有晕环。2对VPp1、VPp2、VPp3进行初步鉴定及电镜观察显示，结果表明：VPp1、VPp2、VPp3分属三株不同的噬菌体；遗传物质均为双链DNA；都有一个正二十面体的头部，头部直径分别为44nm、64nm、89nm。VPp1无尾，属盖噬菌体科，VPp2、VPp3分别有一条114nm与106nm的尾部，属于肌尾噬菌体科。3对VPp1、VPp2、VPp3进行裂解性能分析比较，结果表明：3株噬菌体的最佳感染复数都比较小，分别为0.0001、0.00001、0.001；潜伏期分别为10min、5min、25min；裂解期分别为20min、25min、75min；裂解量分别为90.3、11.1、45.3。综合分析各因素，发现VPp1是符合条件的潜伏期短裂解量大的理想噬菌体株系，因此选定VPp1用于后续实验。紫外线照射实验结果表明VPp1对紫外线非常敏感，照射20s存活率即下降60%以上，照射1min存活率只剩下13%。VPp1全基因组序列包含64个推定基因，每个推定基因在数据库上进行同源性比对分析，结果表明VPp1是一株新发现的噬菌体。4为了使细菌细胞内的NADH更多的释放到胞外，本研究从噬菌体效价、裂解时间、噬菌体与宿主菌的体积比三个方面进行噬菌体裂解宿主菌的裂解条件优化，结果表明：噬菌体效价越高越能在短时间内将宿主菌裂解完全，考虑到噬菌体增殖液制备的便利性，检测体系中确定噬菌体的效价为1010pfu/mL；裂解时间为15min；体积比为1:1。5将噬菌体VPp1结合细菌荧光素酶-FMN:NADH氧化还原酶体外发光体系进行副溶血弧菌的定量检测，结果表明：副溶血弧菌的数量在0.31×10~8~6.18×10~8cfu/mL范围内时，曲线的拟合方程为y=1938.3x+2906.1，两者线性相关系数R~2值为0.9813，呈现一定的线性关系；副溶血弧菌的数量在0.31×10~8~5.03×10~8cfu/mL范围内时，曲线的拟合方程为y=2129.4x+2611.5，两者线性相关系数R2值为0.9954，线性关系良好。方法检出限为2.64×10~7cfu/mL。在副溶血弧菌纯培养液及牡蛎样品中的平均加标回收率分别为96.28%与91.92%，表明方法准确度高，具有可行性。在VP纯培养液及牡蛎样品中的重复性试验结果表明，相对标准偏差RSD分别为0.72%与0.68%，均小于1%，表明该方法重复性好，精密度高。牡蛎样品中的增菌检测实验结果表明，初始浓度为100cfu/mL的牡蛎样品经4h增菌，检测体系可以明显的检测到。整个检测过程（包括增菌过程与裂解测定过程）在4.5h之内可以完成。总之，本试验分离得到的3株副溶血弧菌噬菌体VPp1、VPp2、VPp3，分析比较其裂解性能，选定VPp1结合细菌荧光素酶-FMN:NADH氧化还原酶体外发光体系用于副溶血弧菌的定量检测，并在牡蛎样品中初步验证了方法的可行性。