微孢子虫（microsporidia）是一类专性细胞内寄生的单细胞病原真菌。其宿主范围广泛,几乎能感染所有动物包括人类。第一种被报道的微孢子虫是家蚕微粒子虫（Nosema bombycis）,距今已经150多年的历史。其感染家蚕后能够水平传播和经卵垂直传播,导致后代大面积死亡,严重影响了蚕业的发展。近年来,随着分子生物学的发展,微孢子虫的基因组研究发展迅速。目前已经完成了兔脑炎微孢子虫（Encephalitozoon cuniculi）、蝗虫微孢子虫（Nosema locustae）、家蚕微粒子虫等多种微孢子虫的全基因组测序。微孢子虫的研究已经进入后基因组时代了,深入研究微孢子虫的基因功能尤为重要。目前,微孢子虫基因功能的研究只能通过同源性分析预测基因功能以及体外实验研究,缺乏体内研究证据。并且微粒子虫的大部分基因与其它生物几乎没有同源性,我们无法对其研究。正是因为缺乏有效的遗传操作体系,极大的限制了对家蚕微粒子虫的研究,导致了微粒子虫研究瓶颈。因此亟需建立有效的家蚕微粒子虫遗传操作体系。而此系统的瓶颈之一在于缺少可用的转化子筛选药物与特异的筛选标记,这极大的限制了其遗传操作系统的效率。因此,本研究在实验室前期工作的基础上,通过探索外源基因的转染方法、优化转基因载体元件和建立高效的药物筛选富集系统,从这三个方面进行探究对遗传操作体系进行优化,为建立高效的遗传操作体系奠定基础,提供新的方法。主要研究结果如下:1.家蚕微粒子虫外源基因转染方法及时期的研究本研究首先选用家蚕肌动蛋白A3基因启动子,结合带有piggyBac转座子的载体,构建了pBac-[IE2-HK]-[A3-EGFP]载体。并制备了不同N/P值的HTCC/pDNA复合物,确定制备复合体的配方,并探索了季铵化壳聚糖（HTCC）介导转染家蚕微粒子虫的方法。随后利用脂质体法和HTCC法分别进行转染,将质粒导入家蚕微粒子虫成熟孢子中,添至宿主细胞中进行培养,在转染9天后两种方法都观察到了发出绿色荧光的孢子。分别采用脂质法和HTCC法,在不同的时期对感染家蚕微粒子虫的宿主细胞进行转染,发现脂质体转染组,在感染0 h和12 h观察到了绿色荧光孢子,HTCC转染组均未观察到绿色荧光孢子。以上研究结果表明,通过脂质体法转染家蚕微粒子虫成熟孢子,导入外源基因是可行的,转染最佳时期为微粒子虫侵染细胞后0 h-12 h内;HTCC法转染感染家蚕微粒子虫的宿主细胞的最佳时期仍不确定,且现阶段转染家蚕微粒子虫成熟孢子的效果不稳定。2.家蚕微粒子虫转化子药物筛选体系的建立为了便于从数量庞大的家蚕微粒子虫中快速筛选富集到转化子,本研究建立了药物筛选富集系统。实验室前期对巴龙霉素、多菌灵等药物进行了筛选,但没有获得能有效抑制家蚕微粒子虫增殖并能筛选出转化子的药物。在此基础上,本研究根据微孢子虫胞内寄生的特点,初步选择了红霉素（Erythromycin）、土霉素（Oxytetracycline）、壮观霉素（Spectinomycin）、G418（G418 sulfate）、硫链丝菌素（Thiostrepton）、潮霉素（Hygromycin B）、烟曲霉素（Fumagillin）等不同作用机制的药物,设计了不同浓度梯度进行了宿主细胞毒性评估,确定了最大安全浓度,并且评估了它们抑制微孢子虫增殖的能力。最终结果表明G418、壮观霉素和烟曲霉素在可用浓度范围内,能够有效抑制家蚕微粒子虫增殖。随后分别构建了含有对应抗性基因的三种转基因载体,对家蚕微粒子虫转染并在宿主细胞中进行药物筛选培养。通过qPCR检测抗性基因的表达量以及家蚕微粒子虫β-tubulin基因的表达量来评估突变体的筛选效果,发现烟曲霉素可用于筛选转化子。以上研究结果首次表明,来自酵母菌的甲硫氨酸氨肽酶I（MAPI）基因可以作为家蚕微粒子虫遗传操作体系的抗性基因,并可以利用烟曲霉素作为筛选药物来筛选转化子。3.家蚕微粒子虫转基因载体元件优化为了优化外源基因的表达水平,便于后续显微观察和药物筛选,对转基因载体元件进行优化。我们选择可以编码荧光强度更高的荧光蛋白基因（mNeonGreen）作为报告基因,以此来增强转化子的荧光强度。并结合实验室前期所得的家蚕微粒子虫侵染家蚕中肠早期的转录组数据,选定了10个家蚕微粒子虫中表达量较高的基因,通过qPCR确证出了其中4个表达量相对较高的基因。根据家蚕微粒子虫基因组数据库信息,对4个基因以及后期表达量极高的极管蛋白2,3的上游调控序列进行分析预测启动子序列,并分别克隆其启动子序列用于调控报告基因的表达。随后,构建了六个含有不同启动子的mNG荧光蛋白表达载体,通过脂质体转染将载体导入受体中。结果显示,目的基因有转录,但未能观察到绿色荧光的家蚕微粒子,后续研究将进一步筛选其他适用的强启动子。