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目的：1.研究内质网应激(endoplasmic reticulum stress response, ER stress)状态对人乳腺细胞MDA-MB-231和MDA-MB-435侵袭迁移的影响。2.研究ER stress对乳腺癌细胞中乙酰肝素酶(heparanase, Hpa)表达及活性的影响。3.探讨是否可通过肝素酶抑制剂OGT2115和低分子量肝素(Low molecular weight heparin, LMWH)抑制Hpa而调控ER stress对乳腺癌细胞侵袭迁移的影响。4.检测ER stress状态下侵袭迁移相关蛋白的变化,探讨参与ER stress调控Hpa的机制。方法：1.以侵袭能力较强的乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-435为研究对象,使用化疗药物阿霉素(adriamycin, ADM)和ER stress经典诱导剂衣霉素(tunicamycin,TM)诱导细胞ER stress,不同浓度ADM作用于乳腺癌细胞24h、48h、72h后使用MTT比色法检测细胞活性,并据此选择对细胞增殖影响较小的浓度进行接下来的侵袭迁移实验。2.以乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-435为对象,ADM和TM处理一段时间后Western blot检测ER stress标志蛋白GRP78和CHOP的表达。3.使用Transwell法检测ADM和TM对两株乳腺癌细胞侵袭迁移的影响,细胞划痕实验观察细胞的迁移能力。同时使用Western blot、ELISA法检测ADM、TM刺激乳腺癌细胞后Hpa表达活性的变化。4.使用肝素酶抑制剂OGT2115/LMWH后,Transwell法再次检测ER stress状态下两株细胞的侵袭和迁移的变化；ELISA法检测Hpa的变化以及Western blot检测ER stress时侵袭迁移相关蛋白如基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase, MMP) MMP-9, IκB-α和上皮细胞间质转型(epithelial-mesenchymal transition, EMT)蛋白的变化。结果：1.ADM和TM影响乳腺癌MDA-MB-231、MDA-MB-435(?)田胞增殖和侵袭迁移的作用MTT结果显示,ADM能明显抑制两株乳腺癌细胞的增殖,抑制活性随着作用时间和剂量的增加而增加；选用对细胞增殖影响较小浓度的ADM和TM进行Transwell侵袭迁移实验,结果发现低浓度如ADM (0.2μmol·L-1)和TM(0.75μmol·L-1)一定程度上可以增加乳腺癌细胞的侵袭迁移(p<0.05)。2. ADM和TM诱导ER stress和HpaADM (0.2μmol·L-1)作用于乳腺癌MDA-MB-231、MDA-MB-435细胞24h后,Western blot检测结果发现,化疗药物ADM可以引起ER stress,6h即可检测到标志蛋白GRP78表达明显升高。TM作为经典诱导剂,TM (0.75μmol·L-1)作用于两株乳腺癌细胞后,Western blot检测GRP78明显升高,验证了TM诱导ER stress的能力。ADM和TM刺激两株乳腺癌细胞24h、36h后,Western blot和ELISA法检测Hpa的表达活性,结果发现诱导ER stress可激活Hpa,16h和24h时Hpa明显升高,继而引起了一系列侵袭迁移的后效应。3.肝素酶抑制剂OGT2115对ER stress状态下乳腺癌MDA-MB-231、MDA-MB-435细胞侵袭迁移的影响考虑到Hpa在ER stress增强乳腺癌细胞侵袭迁移的过程中可能起着关键作用,我们使用Hpa本身活性抑制剂OGT2115以观察其是否可以抑制ER stress引起的细胞侵袭迁移。MTT检测发现OGT2115对乳腺癌细胞的增殖抑制作用不强,但和ADM联合后不会减弱ADM的抗肿瘤增殖作用。ELISA检测结果发现OGT2115可以抑制Hpa活性,并且可以明显抑制被ADM/TM激活的Hpa活性,DGT2115(0.8μmol·L-1)单独作用于乳腺癌细胞后可以轻度抑制细胞侵袭迁移,并且可以能明显减少由ER stress引起的细胞侵袭迁移(p<0.05)。4. LMWH对ER stress状态下乳腺癌MDA-MB-231、MDA-MB-435细胞侵袭迁移的影响使用Hpa的另一类抑制剂肝素类似物LMWH进行重复实验,MTT检测LMWH可以轻度抑制乳腺癌细胞的增殖,抑制活性随着作用时间和剂量的增加而增加。ELISA检测结果发现LMWH能明显抑制由ADM/TM激活的Hpa活性,使用LMWH (500IU·ml-1)可以明显减少ADM (0.2μmol·L-1)/TM (0.75μmol·L-1)引起的细胞侵袭迁移(p<0.05),结果与OGT2115的实验结果相符合。5.检测ER stress状态下侵袭迁移相关蛋白的变化通过上述实验可知,Hpa在ER stress增加乳腺癌细胞侵袭迁移的过程中有重要的作用,Hpa的表达受到很多因素的影响,Western blot检测可知TM(0.75μmol·L-1)刺激乳腺癌细胞24h后MMP-9升高,IκB-α降低,NF-KB被激活,EMT蛋白E-cadherin降低、β-catenin降低、vimentin升高,提示可能诱导出现了EMT。使用Hpa抑制剂可以对EMT蛋白进行调控,这提示我们EMT相关通路可能参与了ER stress激活Hpa的过程。结论：1.相关浓度化疗药物ADM、TM促进乳腺癌MDA-MB-231、MDA-MB-435细胞侵袭和迁移,这与化疗药物诱导的ER stress保护细胞作用过度激活了Hpa密切相关。2.通过抑制(?)Hpa可以减少由ER stress引起的乳腺癌MDA-MB-231、MDA-MB-435细胞侵袭迁移。3.EMT可能参与至(?)ER stress激活Hpa的过程中,其共同影响了ER stress状态下乳腺癌细胞的侵袭迁移。