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苹果树腐烂病(Apple tree valsa canker)由死体营养型真菌黑腐皮壳属Valsa mali Mayabe et Yamada引起,可致树干皮层腐烂,树势衰弱,使得苹果产量降低,品质下降,造成严重的经济损失。真菌毒素是植物病原真菌在侵染和致病过程中产生的一类具备致病活性的小分子代谢产物,而死体营养真菌的基因组中含有非常丰富的与毒素代谢相关的基因。研究表明,细胞色素P450(CYP)在死体营养型真菌的毒素合成代谢过程中有重要作用,预测与病原菌致病相关。为了探究苹果树腐烂病菌CYP基因在病菌侵染过程中的作用,本研究选取苹果树腐烂病菌V.mali毒素合成基因簇中的全部28个细胞色素P450基因(VM1G＿00042、VM1G＿00043、VM1G＿02313、VM1G＿02575、VM1G＿03094、VM1G＿03153、VM1G＿03188、VM1G＿03596、VM1G＿04956、VM1G＿04960、VM1G＿04962、VM1G＿04973、VM1G＿04974、VM1G＿06772、VM1G＿06783、VM1G＿07082、VM1G＿07088、VM1G＿07096、VM1G＿07333、VM1G＿07348、VM1G＿08239、VM1G＿08245、VM1G＿08826、VM1G＿09622、VM1G＿09625、VM1G＿09631、VM1G＿09634、VM1G＿09643)为研究对象,明确CYP基因对病原菌致病力影响,为细胞色素P450基因家族对苹果树腐烂病菌致病机理的进一步研究提供依据。本研究利用Double-joint PCR技术构建目的基因敲除载体,通过PEG介导的原生质体转化技术筛选获得突变体,并借助PCR检测及Southern Blotting最终验证得到单拷贝敲除突变体。对野生型菌株03-8及敲除突变体进行生物学观察和致病力测定,并通过gap-repair技术对目的基因进行功能回复验证。最后,对敲除突变体黑色素基因簇的6个基因(VM1G＿00287、VM1G＿00288、VM1G＿00289、VM1G＿00290、VM1G＿00291和VM1G＿00292)进行q RT-PCR检测,分析敲除突变体的黑色素基因簇表达水平。具体研究结果如下:1、利用Double-joint PCR技术成功构建了28个CYP基因的敲除盒,并通过PEG介导的遗传转化获得21个CYP基因的共计30个阳性转化子。经Southern Blotting验证,最终得到其中15个CYP基因的18个单拷贝敲除突变体。2、对敲除突变体进行表型观察发现,ΔVM1G＿02575-59生长减弱,对Na~+和K~+胁迫表现出一定的敏感性。ΔVM1G＿04956-58、ΔVM1G＿04974-222产孢量分别减少57.6%、73.5%。ΔVM1G＿03094-5与野生型菌株03-8相比菌落颜色呈白色,产孢量减少51.3%。互补突变体菌落形态及产孢近似恢复至野生型菌株03-8水平。3、对敲除突变体进行致病力检测发现,ΔVM1G＿03094-5的致病力较野生型菌株相比降低24.5%。互补突变体致病力近似恢复至野生型菌株03-8水平。4、ΔVM1G＿03094-5的黑色素基因簇表达量实时定量PCR分析结果表明,与野生型菌株03-8相比,黑色素基因簇上的6个基因在突变体ΔVM1G＿03094-5中的表达量均下调,下调倍数分别为4.0、8.9、1.8、2.2、4.8和2.9倍。综上所述,本研究表明VM1G＿03094基因与病原菌黑色素合成、子实体的产生和致病力相关。VM1G＿02575、VM1G＿04956、VM1G＿04974与病原菌的生长发育相关,其中VM1G＿02575参与苹果树腐烂病菌V.mali的盐离子胁迫应答。