耐Cd细菌的筛选及抗性机理研究

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重金属污染是世界普遍存在的环境问题。修复和治理重金属污染的研究中,微生物修复治理是一条有效的途径,其中一个重要的工作即使从环境中筛选和获得能耐受和高富集重金属的微生物,在此基础上进一步优化而达到修复和治理环境中重金属的目的。现代微生物学和分子生物学技术的蓬勃发展为此方面的研究提供了高效便利的手段。当前相关研究的一个重点仍在于获得重金属高耐受和富集的微生物,并试图从其机理上有所突破和利用。本研究主要分两部分,首先利用生物信息学对将常见微生物的重要Cd相关蛋白—Cd转运蛋白(Cadmium Resistance Transporter)进行同源比对及进化分析。研究发现:Cd转运蛋白的氨基酸序列具有明显的种属特异性,来源于同一个属的蛋白质序列很好的聚类。葡萄球菌(Staphyloeoccus) Cd转运蛋白属内存在较大的差异,而芽孢杆菌属(Bacillus)以及分枝杆菌属(Mycobacterium)的蛋白序列有较好的保守性;它们都是4次以上跨细胞膜蛋白,这与跨膜转运的功能一致,体现了蛋白质结构和功能的统一。Cd转运蛋白质序列的二级结构主要是α-螺旋,β-折叠和无规则卷曲,除B.cereus.R309803外,序列中最多的二级结构是α-螺旋。从三级结构域预测发现,Cd转运蛋白序列折叠主要以药物输出转运子AcrB跨膜蛋白(multidrug effiux transporter AcrB transmembrane domain)为主,此种结构非常稳定、高效。在生物信息分析的基础上,对Cd耐受或富集微生物进行了筛选、优化和鉴定,并对其Cd吸附及作用机理进行了初步的研究和探讨。采集来自成都郊区某化工厂排污口污泥,稀释浓度后,利用Cd2+浓度梯度递增法分离筛选。在200mg/L Cd2+培养基上得到了一株具有较高抗性的菌株,结果如下:●进行形态学分析,生理生化实验,16SrDNA鉴定,菌株确定为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacea)。●该菌株生长速度快,环境要求低,能够在M9培养基上生长。经过紫外诱变,对Cd的吸附能力提高9%,吸附量达到54mg/g。●菌株能在1500mg/L Cd2+液体培养基,400mg/L Cd2+固体培养基中生长。菌株的最佳生长条件是:pH6.4牛肉膏培养基,34℃培养,液体培养22-34h为宜。●菌株不含抗性质粒,对Cd的抗性可能由基因组编码。透射电镜(TEM)观察细菌吸附Cd后的变化,分析结果表明:吸附Cd2+后细胞表面粗糙,呈不规则的凸起,菌体膨大,周围有沉淀。细菌可能分泌某种化合物与Cd2+产生沉淀。细胞质中出现大小不一的空泡,证明了Cd对细菌的毒害作用,菌体出现凋亡特征。阴沟肠杆菌耐镉机理初步判断为胞外沉淀。最后经查阅资料和实验分析得出以下结论:生物信息学分析对实验有指导辅助作用;Cd转运蛋白(Cadmium Resistance Transposer)有明显的种属特异性和相类似的三级结构;筛选得到阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacea)对Cd具有高耐受高富集性,可作为基因工程宿主菌、生物吸附剂材料等;它对Cd的耐受富集作用机理初步认定为胞外沉淀。
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