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蓝舌病(Bluetongue)是由蓝舌病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的一种严重侵害绵羊、牛和鹿等反刍动物的、有虫媒传播的急性非接触性传染病。近年来蓝舌病在欧洲数次暴发,引起了重大经济损失。世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health,OIE)将其列为必须申报的动物传染病。Viperin蛋白是2001年发现的一种干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes,ISGs),能被多种病毒甚至细菌诱导表达,并且已证实具有抑制病毒复制、免疫调节和代谢调节的功能。但是目前未见Viperin蛋白抑制BTV复制的相关报道。本研究利用RT-PCR方法从原代绵羊睾丸(PST)细胞和牛肾细胞(MDBK)中扩增牛、羊Viperin基因,利用分子生物学软件对其进行生物信息学分析和预测,然后构建真核表达载体,将其转染细胞后评价两种Viperin蛋白在BTV复制过程中的作用。本实验首先利用实时定量PCR分析了BTV感染后Viperin基因转录水平的变化,结果显示,BTV感染的PST、MDBK细胞以及绵羊血液中Viperin基因的转录水平均明显升高。参考已公布的牛、羊Viperin mRNA序列设计引物,从BTV感染的PST和MDBK细胞中提取总RNA,RTPCR扩增得到与预期大小相符的条带,将其与pMD18-T载体连接后进行序列测定,结果表明,牛、羊Viperin基因的开放阅读框(ORF)均由1092对碱基组成。序列分析发现,牛、羊Viperin蛋白与其它物种的Viperin结构非常相似,均含有N末端、S-腺苷-L-甲硫氨酸(radical S-adenosyl methionine,SAM)和C末端结构域,亮氨酸拉链(leucine zipper)和SAM结构域中的基序序列高度保守。进化树分析表明,牛、羊Viperin与羊驼、野牦牛和藏羚羊等反刍动物Viperin遗传关系较近,与其它动物Viperin的遗传关系较远。VP5是BTV外层衣壳的重要组成蛋白,具有膜渗透功能,介导病毒粒子从内吞体释放进入细胞质。本实验实现了VP5 N端缺少41个氨基酸的截短蛋白VP5?41aa在大肠杆菌表达系统中的高效表达和纯化,将其免疫新西兰白兔后制备了多克隆抗体,Western blot和细胞免疫荧光实验表明,该抗体不仅能与重组表达的VP5?41aa蛋白反应,而且能与BTV感染细胞中具有天然构象的VP5蛋白反应,为后续评价病毒复制效率提供了重要的抗体检测工具,也为深入研究VP5蛋白的生物学功能奠定了基础。为了进一步研究牛、羊Viperin在BTV感染过程中的作用,将牛、羊Viperin基因亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了带有Flag标签的牛、羊Viperin基因真核表达质粒,分别转染BHK-21细胞,评价其对BTV复制效率的影响。结果显示,牛、羊Viperin蛋白在BHK-21细胞中成功表达,与对照组相比,表达牛、羊Viperin的细胞中,BTV结构蛋白VP5、VP6以及非结构蛋白NS1表达量明显下降。实时定量PCR显示,过表达Viperin蛋白可以有效降低BTV NS3mRNA的水平。蚀斑分析结果进一步证实,牛、羊Viperin基因过表达明显降低了病毒滴度。以上研究表明牛、羊Viperin均可有效抑制BTV的复制,在抗BTV感染的过程中可能发挥重要作用。