第一部分人退变椎间盘髓核细胞的分离、体外培养目的:探讨人退变椎间盘髓核细胞的分离、体外培养方法。方法:收集15例人退变椎间盘髓核组织,采用0.025%的Ⅱ型胶原酶与0.004%脱氧核糖核酸酶Ⅱ消化分离出髓核细胞并连续培养传代,倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,免疫细胞化学法行Ⅱ型胶原染色,甲苯胺蓝染色检测髓核细胞内聚集蛋白聚糖的表达,观察髓核细胞的类软骨表型的表达。结果:采用0.025%的Ⅱ型胶原酶加0.004%的脱氧核糖核酸酶Ⅱ4℃过夜消化可较好的分离培养出人退变椎间盘髓核细胞;原代髓核细胞平均7天贴壁,细胞呈类圆形或多角形,细胞95%融合所需时间约4周;聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原表达于分离培养的髓核细胞,被甲苯胺蓝染成天蓝色,Ⅱ型胶原染色为黄褐色。结论:采用0.025%的Ⅱ型胶原酶加0.004%的脱氧核糖核酸酶Ⅱ消化法体外成功培养出髓核细胞;髓核细胞呈类软骨表型,合成分泌聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原蛋白。第二部分人骨髓间充质干细胞的体外分离培养、鉴定及其诱导分化目的:体外分离培养、鉴定人骨髓间充质干细胞,并检测其多向分化潜能。方法:取正常成人骨髓,应用密度梯度离心法与贴壁培养法分离、纯化人骨髓间充质干细胞并在体外进行培养,倒置显微镜观察细胞形态特征;流式细胞仪检测细胞表面抗原,并利用成骨诱导剂、成脂诱导剂、成软骨诱导剂诱导人骨髓间充质干细胞向成骨、成脂、成软骨方向分化,碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色、油红O染色、Safranin’O-Fast Green染色、阿利新蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学法检测其定向分化。结果:培养的细胞呈长梭形外观;流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞CD29、CD44、CD90表达阳性,CD34、CD45、HLA-DR表达阴性。细胞经过诱导液诱导14天后,碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色、油红O染色、Safranin’O-Fast Green染色、阿利新蓝染色、Ⅱ型胶原染色阳性。结论:通过密度梯度离心法与贴壁培养法可大量扩增、纯化人骨髓间充质干细胞,骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能。第三部分人骨髓间充质干细胞与退变髓核细胞体外共培养下的相互影响目的:研究体外人退变髓核细胞(nucleus pulposus cells, NPCs)与骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMMSCs)共培养时,NPCs对BMMSCs的诱导分化效应,以及BMMSCs对NPCs生物活性的影响。方法:取第3代的BMMSCs与第1代NPCs在Transwell板中共培养,建立3个细胞培养组,BMMSCs与NPCs共培养组,BMMSCs单独培养组和NPCs单独培养组。分别于共培养4、8、12天后检测细胞培养上清液中转化生长因子β1(TGF-β1)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板衍化生长因子(PDGF)的含量变化以及BMMSCs与NPCs的增殖能力;采用RT-PCR法检测不同培养时间点BMMSCs与NPCs的I、Ⅱ型胶原蛋白、蛋白聚糖Aggrecan及Sox-9基因表达变化。倒置显微镜观察共培养后BMMSCs及NPCs的形态学变化。结果:从第4天起,共培养组上清液中TGF-β1、IGF、PDGF的含量较BMMSCs单独培养组、NPCs单独培养组显著增高(P<0.05),且随培养时间的延长而逐渐增加。共培养组中BMMSCs与NPCs细胞数量较BMMSCs单独培养组、NPCs单独培养组明显增多(P<0.05)。从第4天开始的各个时间点,共培养组NPCs的聚集蛋白聚糖Aggrecan、Sox-9基因表达较单独培养组高(P<0.05),并且Ⅱ型胶原在第12天的表达也显著高于单独培养组(P<0.05);同时从第8天起至第12天,共培养组BMMSCs的Ⅱ型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖Aggrecan、Sox-9基因的表达较单独培养组高(P<0.05)。共培养12d后,BMMSCs及NPCs形态未见有明显变化。结论:骨髓间充质干细胞与髓核细胞共培养时,骨髓间充质干细胞在髓核细胞营造的微环境下向类髓核细胞转化;骨髓间充质干细胞可通过分泌TGF-β1、IGF、PDGF等细胞因子发挥其营养效应,激活髓核细胞,促进其增殖及细胞外基质的合成。第四部分TGF-β1对不同程度退变椎间盘的髓核细胞生物活性的影响目的:采用外源性转化生长因子β1(TGF-β1)模拟骨髓间充质干细胞的营养效应,探讨该营养效应对不同程度退变椎间盘的髓核细胞(nucleus pulposus cells, NPCs)生物学活性的影响。方法:取Ⅱ、Ⅲ、IV度退变椎间盘标本各2例体外培养髓核细胞,建立Ⅱ度退变组、Ⅲ度退变组、IV度退变组及各自的对照组。实验组均给予10ng/ml TGF-β1干预,于第4天检测NPCs的增殖能力;采用荧光定量PCR法检测NPCs的I、Ⅱ型胶原蛋白、蛋白聚糖Aggrecan及Sox-9基因表达变化;Western-blot蛋白印迹分析鉴定蛋白聚糖和p53蛋白在各组NPCs中的表达;β-半乳糖苷酶染色观察NPCs衰老情况。结果:经TGF-β1干预4天后,各退变组NPCs数量皆有不同程度的增加,但Ⅱ度退变组NPCs数量较Ⅲ、IV度退变组增加显著(P<0.05)。TGF-β1干预前各退变组NPCs I型胶原、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖Aggrecan及Sox-9基因表达未见明显差异。TGF-β1干预4天后,各退变组NPCs的基因表达显著增加,但Ⅱ度退变组NPCs的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖及Sox-9基因表达较Ⅲ、IV度退变组NPCs增加显著(P<0.05)。Western-blot检测也显示Ⅱ度退变组NPCs蛋白聚糖合成显著优于Ⅲ、IV度退变组(P<0.05)。β-半乳糖苷酶染色显示Ⅲ、IV度退变组NPCs衰老发生率明显高于Ⅱ度退变组NPCs(P<0.05)。p53蛋白在Ⅲ、IV度退变组中的表达也明显高于Ⅱ度退变组(P<0.05)。Ⅲ度退变组与IV度退变组之间未见明显差异。结论:一定浓度的TGF-β1能够激活退变髓核细胞,促进其增殖及细胞外基质的合成。但椎间盘退变程度可通过影响髓核细胞的生物学表型,影响TGF-β1干预的效果。这表明椎间盘退变程度可影响骨髓间充质干细胞植入后所分泌的TGF-β1的营养效应,由此影响骨髓间充质干细胞移植治疗的效果。