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目的1构建SARI基因过表达慢病毒重组质粒载体并完成相关鉴定。2SARI过表达对急性白血病(AML)细胞株增殖、凋亡等生物学活性的影响。3探讨相关的分子机制。方法1构建、包装并鉴定SARI基因过表达慢病毒重组载体(由上海吉凯基因化学技术有限公司完成)。2通过qPCR筛选SARI低、中表达的AML细胞株作为实验细胞株,并应用SARI基因过表达慢病毒转染实验细胞株,而后应用Western blot及qPCR完成过表达鉴定。3采用MTT比色法、细胞克隆形成实验等,观察SARI过表达对AML细胞增殖的影响;采用Annexin V-PE/7-AAD双荧光标记经流式细胞术(FCM)、FCM测线粒体膜电位变化、AO染色、DAPI染色等方法检测细胞凋亡,采用PI染色经FCM检测细胞周期等研究SARI过表达对AML细胞株细胞凋亡、周期的影响。4 Western blot检测凋亡相关蛋白、凋亡途径相关蛋白;Western blot、RT-PCR检测相关通路蛋白、mRNA及可能与SARI相互作用的转录因子,探讨SARI过表达对AML细胞增殖、凋亡影响的分子机制。结果1测序鉴定结果与目标序列完全一致,包装后的慢病毒经荧光法测定滴度约为5×108TU/ml。2确定SARI低、中表达的AML细胞株Kasumi-1、HL-60、NB4为实验细胞株。3 SARI基因过表达慢病毒重组质粒染转实验细胞株72h后,观察到GFP稳定表达。qPCR检测显示SARI组细胞SARI在mRNA水平表达增加。Western blot法检测到约29kD的蛋白表达。MTT比色法实验显示,Kasumi-1、HL-60、NB4细胞中SARI组的细胞生长较两对照组明显受抑制(p<0.05)。克隆形成实验表明,Kasumi-1、HL-60、NB4细胞中SARI组细胞克隆形成率较两对照组显著降低(p=0.000)。DAPI染色显示及AO染色显示Kasumi-1、HL-60、NB4细胞中SARI组的细胞生长较两对照组无明显差异,经AnnexinV-PE/7-AAD双荧光染色后经FCM检测显示,Kasumi-1、HL-60、NB4细胞中SARI组细胞凋亡率明显高于其他两对照组(p<0.001),主要为早期凋亡,经FCM检测线粒体膜电位显示,Kasumi-1、HL-60、NB4细胞中SARI组的细胞生长较两对照组线粒体膜电位显著降低(p<0.05)。4 Western blot检测显示Kasumi-1、HL-60、NB4细胞中SARI组细胞较NC组Bcl-2、Bcl-xl表达下调(p<0.05),Bax、Cyto C表达增加(p<0.05),同时HL-60、NB4细胞中SARI组细胞较NC组细胞均有通过凋亡途径相关蛋白Caspase9、Caspase8和Caspase3的剪接激活,上调Actived-Caspase3,剪切PARP,出现PARP剪切体,而Kasumi-1细胞中SARI组细胞较NC组细胞则通过凋亡途径相关蛋白Caspase9、Caspase8和Caspase3的上调而激活Actived-Caspase3,剪切PARP,出现PARP剪切体。5Western blot显示Kasumi-1、HL-60、NB4细胞中SARI组细胞较NC组细胞出现PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、4EBP1、p-4EBP1、mTOR、p-mTOR、p70蛋白下调,MAPK蛋白无明显变化,RT-PCR显示STAT1 mRNA无明显变化。RT-PCR检测显示三种细胞株中SARI组细胞的可能与SARI相互作用的转录因子表达情况,其中MZF-1 mRNA明显下调,IL-8、AML1、TWIST mRNA不同程度下调,而Western blot检测显示三种细胞株中SARI组细胞NF-κB(RelA)、C-myc蛋白的表达受到不同程度抑制。结论构建了SARI基因过表达慢病毒重组载体,在Kasumi-1、HL-60、NB4细胞中SARI基因过表达可明显抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,主要为早期凋亡,这可能是通过激活外源性凋亡途径及与其交叉的内源性凋亡途径、抑制PI3K信号通路、抑制转录因子MZF-1、NF-κB(Rel A)、IL-8、AML1、TWIST、C-myc的表达,尤其是可能与抑制MZF-1、NF-κB(RelA)的表达,而参与抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡从而发挥抑癌作用。