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目的纯化出重组蛋白IP、MOMP、PILE,观察目的蛋白对RWA264.7巨噬细胞吞噬功能、趋化功能、分泌细胞因子功能的影响,并对其机制进行初步研究。方法用IDA His·Bind树脂纯化目的蛋白。RAW264.7巨噬细胞与目的蛋白进行体外共孵育,CCK-8 Kit检测目的蛋白对RAW264.7巨噬细胞的毒性,统计出细胞的半数致死浓度IC50,实验组为目的蛋白的高、中、低浓度组(IC50/5、IC50/10、IC50/20),并设细胞对照组(只加培养液的RAW264.7巨噬细胞)。将四组细胞分别培养24h、48h、72h,用中性红吞噬实验检测RAW264.7巨噬细胞的吞噬功能;培养24h后,用Transwell小室检测RAW264.7巨噬细胞的趋化功能,留取上清检测趋化因子MCP-1、MIF的含量;分别培养24h、36h、48h后,ELISA检测培养上清中细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10的分泌量;培养6h、12h、24h、36h、48h后,实时荧光定量PCR检测细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、MCP-1、MIF、TNF-α、IFN-γ的mRNA的表达水平;q-PCR和western-blot分别从mRNA水平和蛋白水平检测NOD1、NOD2、RIP2、NLRP3、caspase-1的表达。统计数据用SPSS19.0软件进行处理,检测结果以x±s表示,对于服从正态分布且方差齐的计量资料多组间比较采用单因素方差分析,对于非正态分布的资料采用K个独立样本非参数检验,P<0.05为差异具有统计学意义。利用GraphPad Prism 5.0软件进行图表绘制。结果1.IPTG诱导表达并纯化出大小约为46kDa的重组蛋白IP,50kDa的重组蛋白MOMP,35.7kDa的重组蛋白PILE。2.cck-8检测结果为重组蛋白IP、MOMP、PILE的半数致死浓度分别为6.24μg/mL、5.69μg/mL、6.00μg/mL。3.与细胞对照组相比,随着目的蛋白IP、MOMP、PILE处理RAW264.7巨噬细胞浓度的增加和时间的延长,其吞噬中性红的能力均下降(P<0.05)。4.与细胞对照组相比,随着目的蛋白IP、MOMP、PILE处理RAW264.7巨噬细胞刺激浓度的增加,巨噬细胞趋化功能也随之增加(P<0.05)。5.目的蛋白IP、MOMP、PILE处理RAW264.7巨噬细胞24h后,实验组与细胞对照组相比,Transwell小室细胞培养上清中MCP-1、MIF的分泌含量增加(P<0.05)。组内低、中、高不同浓度比较,趋化因子MCP-1、MIF随着蛋白浓度的增加分泌量依次增加(P<0.05)。6.目的蛋白IP、MOMP、PILE处理RAW264.7巨噬细胞24h、36h、48h后,实验组与对照组相比,炎症因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10分泌增加(P<0.05),并在36h达到峰值,之后开始下降;单个时间点内不同浓度组内比较,上述炎症因子随着蛋白浓度作用的增强分泌量依次增加(P<0.05);7.与细胞对照组相比,目的蛋白IP、MOMP、PILE与巨噬细胞共培养6h、12h、24h、36h、48h后,实验组的细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、MIF的mRNA表达水平增加(P<0.05)。8.与细胞对照组相比,目的蛋白与巨噬细胞共培养6h、12h、24h、36h、48h后,IP、PILE实验组的通路因子NOD1、NOD2、RIP2、NLRP3、caspase-1的mRNA表达水平增加,且在12h达到峰值(P<0.05);目的蛋白MOMP组的通路因子NOD2、RIP2、NLRP3、caspase-1的mRNA表达水平增加,且在12h达到峰值(P<0.05)。9.与细胞对照组相比,目的蛋白与巨噬细胞共培养12h、24h、36h后,目的蛋白IP、PILE组的通路因子NOD1、NOD2、RIP2、NLRP3、caspase-1的蛋白表达水平增加,且在24h达到峰值(P<0.05);目的蛋白MOMP组的通路因子NOD2、RIP2、NLRP3、caspase-1的蛋白表达水平增加,且在24h达到峰值(P<0.05)。结论嗜肺军团菌重组蛋白IP、MOMP、PILE下调RAW264.7巨噬细胞的吞噬功能;增强巨噬细胞的迁移趋化功能;上调细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、MIF分泌表达;IP、PILE蛋白调控巨噬细胞的相关功能可能与NOD1/NOD2/RIP2和NLRP3/caspase-1信号通路有关,但前者通路中NOD2/RIP2的mRNA及蛋白表达水平比NOD1/RIP2更高。MOMP蛋白调控巨噬细胞相关功能可能与NOD2/RIP2和NLRP3/caspase-1信号通路有关。