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第一部分:免疫性冠状动脉炎小鼠血浆炎症因子及血液单个核细胞中miRNA-199b-5p的动态变化目的:观察免疫性冠状动脉炎小鼠血浆炎症因子及血单个核细胞中miRNA-199b-5p的动态变化,预测相关靶基因,为研究免疫性冠状动脉炎的发病机制提供基础。方法:1.分别连续5天给予C57BL/6小鼠腹腔注射白色念珠菌水溶物(8mg/只)或磷酸盐缓冲液(0.1ml/只)。注射后不同时间点(24h、3d、7d、14d、28d)处死小鼠,采血,留取心脏及冠状动脉标本,检测血常规、制备心脏病理切片,确定小鼠免疫性冠状动脉炎模型制作成功。2.分离小鼠血浆标本,酶联免疫吸附实验法测定血浆中IL-6、TNF-α水平。Trizol法提取外周血单个核细胞中总RNA,采用实时定量PCR技术测定其中IL-6、TNF-αmRNA及miRNA-199b-5p水平。3.利用PITA、Target Scan和micro RNAorg数据库进行miRNA-199b-5p靶基因预测,DAVID生物信息学软件对共同靶基因行GO和KEGG分析,获取与免疫性血管炎相关的靶基因。结果:1.小鼠免疫性冠状动脉炎模型成功建立。2.实验组小鼠血浆IL-6、TNF-α水平,在注射后3d、7d时升高(P均<0.05)。单个核细胞中IL-6、TNF-αmRNA水平在注射后3d、7d时升高(P均<0.05),miRNA-199b-5p水平在注射后24h、3d、7d、14d时降低(P均<0.05)。3.数据库预测获得共有90个共同的靶基因,其中与免疫性血管炎有关的为NFKB。结论:1.连续5天腹腔注射白色念珠菌水溶物8mg/只,是构建免疫性冠状动脉炎小鼠模型的合适方法。2.IL-6、TNF-α是参与了免疫性冠状动脉炎的炎症因子。3.miRNA-199b-5p可能通过调控NF-κB靶基因表达,参与冠状动脉炎症的病理过程。第二部分:免疫性冠状动脉炎小鼠血液单个核细胞中miRNA-199b-5p表达与NF-κB及其信号通路相关性研究目的:分析miRNA-199b-5p和NF-κB在冠状动脉炎小鼠中的表达及其意义,探讨miRNA-199b-5p与NF-κB在免疫性冠状动脉炎中的作用及二者之间的关系。方法:实验组C57BL/6小鼠腹腔注射CAWS制作免疫性冠状动脉炎动物模型,对照组小鼠腹腔内注射等体积PBS。分别于注射后24h、3d、7d、14d及28d采集血液,留取其心脏标本。检测:1.RT-qPCR技术检测两组小鼠不同日龄血液单个核细胞中miRNA-199b-5p表达量及NF-κB的mRNA表达水平。2.EVG染色检测小鼠血管弹力纤维改变情况。免疫组织化学测定NF-κB在血管内皮细胞中分布情况的变化。3.Western blot法检测血液单个核细胞中NF-κB蛋白表达水平。比较不同日龄免疫性冠状动脉炎小鼠及对照组间miRNA-199b-5p与NF-κB表达差异,分析二者变化的相关性。结果:1.急性期(3d、7d)实验组小鼠单个核细胞中NF-κB的mRNA表达水平明显高于对照组(p<0.05),亚急性期(14d、28d)差异无统计学意义(p>0.05)。2.小鼠心脏EVG染色显示亚急性期(14d)出现血管弹力纤维破坏。实验组(24h、3d、7d、14d)小鼠免疫组织化学染色显示血管内皮细胞核NF-κB-p65水平明显高于对照组(p<0.05);实验组(3d、7d、14d)小鼠血液单个核细胞Western Blot显示NF-κB水平明显高于对照组(p<0.05),28d组差异无统计学意义(p>0.05)。3.实验组小鼠血液单个核细胞中miRNA-199b-5p表达量与NF-κB水平呈负相关。结论:1.冠状动脉炎小鼠血液单个核细胞、血管内皮细胞中存在NF-κB表达的上调。2.miRNA-199b-5p可能通过改变靶基因NF-κB的表达,调控小鼠免疫性血管炎的炎症反应。